Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese
Summary
Single molecule fluorescentie energieoverdracht is een methode die de tRNA-dynamiek volgt tijdens ribosomale eiwitsynthese. Door individuele ribosomen te volgen, worden inhomogene populaties geïdentificeerd, die licht werpen op mechanismen. Deze methode kan worden gebruikt om biologische conformatieveranderingen in het algemeen te volgen om dynamisch-functierelaties in vele andere complexe biosystemen te onthullen. Single molecule-methoden kunnen niet-snelheidsbeperkende stappen en laagbevolkte sleuteltussenproducten observeren, die niet toegankelijk zijn voor conventionele ensemblemethoden vanwege het gemiddelde effect.
Abstract
Het ribosoom is een groot ribonucleoproteïnecomplex dat eiwitten processief assembleert langs mRNA-sjablonen. De diameter van het ribosoom is ongeveer 20 nm om grote tRNA-substraten op de A-, P- en E-locaties te huisvesten. Bijgevolg wordt de ribosoomdynamiek op natuurlijke wijze snel gedefaseerd. Single molecule-methode kan elk ribosoom afzonderlijk detecteren en inhomogene populaties onderscheiden, wat essentieel is om de gecompliceerde mechanismen van meercomponentensystemen te onthullen. We rapporteren de details van een smFRET-methode op basis van de Nikon Ti2 omgekeerde microscoop om de ribosoomdynamiek tussen het ribosomale eiwit L27 en tRNA’s te onderzoeken. De L27 is gelabeld op zijn unieke Cys 53-positie en gereconstitueerd tot een ribosoom dat is ontworpen om L27 te missen. Het tRNA is gelabeld op zijn ellebooggebied. Naarmate het tRNA zich tijdens de verlengingscyclus naar verschillende locaties in het ribosoom verplaatst, zoals pre- en posttranslocatie, vertonen de FRET-efficiëntie en -dynamiek verschillen, die meerdere subpopulaties hebben gesuggereerd. Deze subpopulaties zijn niet detecteerbaar met ensemblemethoden. De op TIRF gebaseerde smFRET-microscoop is gebouwd op een handmatige of gemotoriseerde omgekeerde microscoop, met zelfgebouwde laserverlichting. De ribosoommonsters worden gezuiverd door ultracentrifugatie, geladen in een zelfgebouwde meerkanaals monstercel en vervolgens verlicht via een evanescent laserveld. De reflectielaserspot kan worden gebruikt om feedbackcontrole van perfecte focus te bereiken. De fluorescentiesignalen worden gescheiden door een gemotoriseerd filterkoepeltje en opgevangen door twee digitale CMOS-camera’s. De intensiteiten worden opgehaald via de NIS-Elements software.
Introduction
Het ribosoom is een ø 20 nm groot ribonucleoproteïnecomplex van een grote (50S) en een kleine (30S) subeenheid. Het assembleert lange peptiden langs de mRNA-sjabloon processief en coöperatief. Het ribosoom 30S bindt zich aan het fMet-tRNAfMet en mRNA om de eiwitsynthese te starten, en de 50S komt dan samen om het 70S-initiatiecomplex te vormen. De tRNA’s brengen aminozuren naar het ribosoom op de A-site (aminoacyl-tRNA-bindingsplaats), terwijl de langwerpige peptidylketen op de P-site (peptidyl-tRNA-bindingsplaats) wordt gehouden. In het pre-translocatiecomplex wordt de peptidylketen overgebracht naar het tRNA op de A-site met één aminozuur toegevoegd. Ondertussen is het P-site tRNA gedeacyleerd. Vervolgens verplaatsen de A-, P-tRNA’s zich naar de P-, E-sites om het post-translocatiecomplex te vormen, waarin de E-site de tRNA-exitsite vertegenwoordigt. In deze toestand verplaatst het peptidyl-tRNA zich terug naar de P-site. De verlengingscyclus gaat door tussen de pre- en post-conformaties terwijl het ribosoom transloceert op het mRNA, één codon per keer1. Het ribosoom is zeer coördinerend van verschillende functionele sites om dit proces efficiënt en nauwkeurig te maken, zoals inter-subunit ratelen2,tRNA hybridisatiefluctuaties3,GTPase-activeringen4,L1-stengel opening-closing5,enz. Bijgevolg defaseren ribosomen snel omdat elk molecuul in zijn eigen tempo beweegt. De conventionele methoden kunnen alleen schijnbare gemiddelde parameters afleiden, maar laagbevolkte of kortlevende soorten zullen worden gemaskeerd in het gemiddelde effect6. Single molecule-methode kan deze beperking doorbreken door elk ribosoom afzonderlijk te detecteren en vervolgens verschillende soorten te identificeren via statistische reconstructie7. Verschillende labelingplaatsen zijn geïmplementeerd om ribosoomdynamica te onderzoeken, zoals de interacties tussen tRNA-tRNA8,EF-G-L119,L1-tRNA10,enz. Bovendien worden door het labelen van de grote en kleine subeenheden, respectievelijk, inter-subunit ratelkinetiek en coördinatie met factoren waargenomen11,12. Ondertussen heeft de smFRET-methode brede toepassingen in andere centrale biologische processen en zijn er meerkleurige FRET-methoden in opkomst13.
Eerder werd een nieuw ribosoom FRET-paar ontwikkeld14,15. Het recombinante ribosomale eiwit L27 is tot expressie gebracht, gezuiverd en gelabeld en weer opgenomen in het ribosoom. Dit eiwit interageerde met de tRNA’s op korte afstand en hielp het P-site tRNA in het post-translocatiecomplex te stabiliseren. Wanneer tRNA zich van de A- naar de P-site verplaatst, wordt de afstand tussen dit eiwit en het tRNA verkort, wat kan worden onderscheiden door het smFRET-signaal. Meerdere ribosoomsubpopulaties zijn geïdentificeerd met behulp van statistische methoden en mutagenese, en spontane uitwisseling van deze populaties in het pre- maar niet posttranslocatiecomplex suggereert dat het ribosoom flexibeler is voordat het op het mRNA beweegt, en meer rigide tijdens het decoderen16,17,18. Deze variaties zijn essentieel voor de ribosoomfunctie. Hier beschrijft het protocol de details van ribosoom / tRNA-labeling, hun opname in het ribosoom, smFRET-monstervoorbereiding en gegevensverzameling / -analyse19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET is gevoelig voor achtergrondsignalen. Eerst is het noodzakelijk om de monsterkamer te coaten met 0,05% tween en vervolgens gelijktijdig met de ribosoomoplossing te worden toegevoegd om de niet-specifieke binding van het ribosoom aan het oppervlak te blokkeren. Om fluorescentie van de acceptor Cy5-emissie te zien, is de zuurstofaasetercocktail (deoxy-, glucose- en Trolox-oplossingen) essentieel. Zonder deze oplossing is het bleken te snel in het acceptorkanaal om nuttige informatie te verkrijgen. Een andere crucial…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01GM111452) en de Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
