Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese
Summary
Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energietransfer ist eine Methode, die die tRNA-Dynamik während der ribosomalen Proteinsynthese verfolgt. Durch die Verfolgung einzelner Ribosomen werden inhomogene Populationen identifiziert, die Aufschluss über Mechanismen geben. Diese Methode kann verwendet werden, um biologische Konformationsänderungen im Allgemeinen zu verfolgen, um dynamische Funktionsbeziehungen in vielen anderen komplexen Biosystemen aufzudecken. Einzelmolekülmethoden können nicht-ratenlimitierende Schritte und dünn besiedelte Schlüsselzwischenprodukte beobachten, die mit herkömmlichen Ensemblemethoden aufgrund des durchschnittlichen Effekts nicht zugänglich sind.
Abstract
Das Ribosom ist ein großer Ribonukleoproteinkomplex, der Proteine prozessiv entlang von mRNA-Schablonen zusammensetzt. Der Durchmesser des Ribosoms beträgt etwa 20 nm, um große tRNA-Substrate an den A-, P- und E-Stellen aufzunehmen. Folglich wird die Ribosomendynamik auf natürliche Weise schnell dephasediert. Die Einzelmolekülmethode kann jedes Ribosom separat detektieren und inhomogene Populationen unterscheiden, was wesentlich ist, um die komplizierten Mechanismen von Mehrkomponentensystemen aufzudecken. Wir berichten über die Details einer smFRET-Methode auf Basis des Nikon Ti2 invertierten Mikroskops zur Untersuchung der Ribosomendynamik zwischen dem ribosomalen Protein L27 und tRNAs. Der L27 wird an seiner einzigartigen Cys 53-Position markiert und zu einem Ribosom rekonstituiert, das so konstruiert ist, dass L27 fehlt. Die tRNA ist an ihrer Ellenbogenregion markiert. Da sich die tRNA während des Dehnungszyklus an verschiedene Stellen innerhalb des Ribosoms bewegt, z. B. vor und nach der Translokation, weisen die FRET-Wirkungsgrade und -Dynamiken Unterschiede auf, die auf mehrere Subpopulationen hindeuteten. Diese Subpopulationen sind mit Ensemble-Methoden nicht nachweisbar. Das TIRF-basierte smFRET-Mikroskop basiert auf einem manuellen oder motorisierten invertierten Mikroskop mit selbstgebauter Laserbeleuchtung. Die Ribosomenproben werden durch Ultrazentrifugation gereinigt, in eine selbstgebaute Mehrkanal-Probenzelle geladen und dann über ein evaneszentes Laserfeld beleuchtet. Der Reflexionslaserspot kann verwendet werden, um eine Rückkopplungskontrolle mit perfektem Fokus zu erreichen. Die Fluoreszenzsignale werden durch einen motorisierten Filterrevolver getrennt und von zwei digitalen CMOS-Kameras gesammelt. Die Intensitäten werden über die NIS-Elements Software abgerufen.
Introduction
Das Ribosom ist ein ø 20 nm großer Ribonukleoproteinkomplex aus einer großen (50S) und einer kleinen (30S) Untereinheit. Es setzt lange Peptide entlang der mRNA-Schablone prozessiv und kooperativ zusammen. Das Ribosom 30S bindet an die fMet-tRNAfMet und mRNA, um die Proteinsynthese zu starten, und das 50S verbindet sich dann zum 70S-Initiationskomplex. Die tRNAs bringen Aminosäuren an der A-Stelle (Aminoacyl-tRNA-Bindungsstelle) zum Ribosom, während die längliche Peptidylkette an der P-Stelle (Peptidyl-tRNA-Bindungsstelle) gehalten wird. Im Prätranslokationskomplex wird die Peptidylkette mit einer Aminosäure auf die tRNA an der A-Stelle übertragen. Währenddessen wird die P-Site tRNA deacyliert. Dann bewegen sich die A-, P-tRNAs zu den P-, E-Stellen, um den Post-Translokationskomplex zu bilden, in dem die E-Stelle die tRNA-Austrittsstelle darstellt. In diesem Zustand bewegt sich die Peptidyl-tRNA zurück zur P-Stelle. Der Dehnungszyklus setzt sich zwischen den Prä- und Postkonformationen fort, während das Ribosom auf der mRNA transloziert, ein Codon nach dem anderen1. Das Ribosom ist in hohem Maße koordinaliv von verschiedenen funktionellen Stellen, um diesen Prozess effizient und genau zu machen, wie z. B. Inter-Subunit-Ratschen2,tRNA-Hybridisierungsschwankungen3,GTPase-Aktivierungen4,L1-Stielöffnung und-schließung 5usw. Folglich entphasen ribosomen schnell, da sich jedes Molekül in seinem eigenen Tempo bewegt. Die herkömmlichen Methoden können nur scheinbare Durchschnittsparameter ableiten, aber dünn besiedelte oder kurzlebige Arten werden im durchschnittlichen Effekt maskiert6. Die Einzelmolekülmethode kann diese Einschränkung durchbrechen, indem jedes Ribosom einzeln nachgewiesen und dann verschiedene Spezies durch statistische Rekonstruktion identifiziert werden7. Verschiedene Markierungsstellen wurden implementiert, um die Ribosomendynamik zu untersuchen, wie z.B. die Wechselwirkungen zwischen tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10usw. Darüber hinaus werden durch die Markierung der großen bzw. kleinen Untereinheiten die Ratschenkinetik zwischen den Untereinheiten und die Koordination mit Faktoren beobachtet11,12. Inzwischen hat die smFRET-Methode breite Anwendungen in anderen zentralen biologischen Prozessen, und mehrfarbige FRET-Methoden entstehen13.
Zuvor wurde ein neuartiges Ribosomen-FRET-Paar entwickelt14,15. Das rekombinante ribosomale Protein L27 wurde exprimiert, gereinigt und markiert und wieder in das Ribosom eingebaut. Dieses Protein interagierte mit den tRNAs aus nächster Nähe und half bei der Stabilisierung der P-Site-tRNA im Posttranslokationskomplex. Wenn sich die tRNA von der A- zur P-Stelle bewegt, verkürzt sich der Abstand zwischen diesem Protein und der tRNA, was durch das smFRET-Signal unterschieden werden kann. Mehrere Ribosomen-Subpopulationen wurden mit statistischen Methoden und Mutagenese identifiziert, und der spontane Austausch dieser Populationen im Prä-, aber nicht Nachtranslokationskomplex deutet darauf hin, dass das Ribosom flexibler ist, bevor es sich auf der mRNA bewegt, und steifer während der Entschlüsselung16,17,18. Diese Variationen sind essentiell für die Ribosomenfunktion. Hier beschreibt das Protokoll die Details der Ribosom/tRNA-Markierung, deren Einbau in das Ribosom, smFRET-Probenvorbereitung und Datenerfassung/-analyse19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET reagiert empfindlich auf Hintergrundsignale. Zuerst ist es notwendig, die Probenkammer mit 0,05% Tween zu beschichten und dann gleichzeitig mit der Ribosomenlösung hinzugefügt zu werden, um eine unspezifische Bindung des Ribosoms an die Oberfläche zu blockieren. Um die Fluoreszenz der Cy5-Emission des Akzeptors zu sehen, ist der Sauerstofffängercocktail (Desoxy-, Glukose- und Trolox-Lösungen) unerlässlich. Ohne diese Lösung ist das Bleichen im Akzeptorkanal zu schnell, um nützliche Informationen zu erhalte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von den US National Institutes of Health (R01GM111452) und der Welch Foundation (E-1721) unterstützt.
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
