Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

O desenvolvimento do cérebro é um processo prolongado que se estende desde a embriogênese até a vida pós-natal. Durante esse tempo, o cérebro integra uma combinação de estímulos intrínsecos e extrínsecos que esculpem a fiação das sinapses entre dendritos e axônios para, finalmente, orientar o comportamento. O cerebelo de roedores é um sistema modelo ideal para estudar como as sinapses se desenvolvem porque o desenvolvimento de um único tipo de neurônio, o neurônio do grânulo cerebelar (CGN), pode ser rastreado à medida que transita de uma célula progenitora para um neurônio maduro. Isso se deve, em parte, ao fato de que a maioria do córtex cerebelar se desenvolve no pós-natal, o que permite fácil manipulação genética e marcação celular após o nascimento¹.

Em mamíferos, a diferenciação de CGN começa no final do desenvolvimento embrionário, quando um subconjunto de células proliferativas no rombencéfalo migra sobre o lábio rômbico para formar uma zona germinativa secundária na superfície do cerebelo ^2,3,4. Embora estejam totalmente comprometidas com uma identidade de progenitor de neurônios de grânulos (PNB), essas células continuam a proliferar dentro da porção externa da camada externa de grânulos (EGL) até o dia 14 pós-natal (P14). A proliferação dessa camada resulta em uma expansão maciça do cerebelo, pois essas células dão origem exclusivamente a CGNs⁵. Uma vez que os CGNs recém-nascidos saem do ciclo celular no EGL, eles migram para dentro em direção à camada interna de grânulos (IGL), deixando para trás um axônio que se bifurcará e viajará na camada molecular do cerebelo, formando fibras paralelas que fazem sinapse nas células de Purkinje⁶. A posição dessas fibras dentro da camada molecular depende do tempo de saída do ciclo celular.

Os CGNs que se diferenciam primeiro deixam suas fibras paralelas em direção ao fundo da camada molecular, enquanto os axônios dos CGNs que se diferenciam posteriormente são agrupados no topo ^7,8. Uma vez que os corpos celulares CGN atingem o IGL, eles começam a elaborar dendritos e formar sinapses com neurônios inibitórios e excitatórios próximos. A árvore dendrítica madura de um CGN exibe uma arquitetura estereotipada com quatro processos principais. Ao longo da maturação da CGN, as estruturas no final desses dendritos formam uma garra que se torna enriquecida com proteínas pós-sinápticas ^9,10. Essas estruturas especializadas, chamadas garras dendríticas, contêm a maioria das sinapses nos neurônios dos grânulos e são importantes para receber tanto entradas excitatórias de inervações de fibras musgosas originárias da ponte, bem como entradas inibitórias de células locais de Golgi. Uma vez totalmente configuradas, as conexões sinápticas dos CGNs permitem que essas células retransmitam entradas de núcleos pré-cerebelares para células de Purkinje, que se projetam do córtex cerebelar para os núcleos cerebelares profundos.

A eletroporação pós-natal in vivo de PNB é vantajosa em relação a outros métodos baseados em marcação, como infecção viral e geração de linhagens transgênicas de camundongos, porque a expressão das construções desejadas pode ser alcançada em uma linha do tempo rápida, e o método tem como alvo uma pequena população de células, útil no estudo dos efeitos autônomos celulares. Este método já foi utilizado em estudos prévios para estudar o desenvolvimento morfológico de CGNs; no entanto, esses estudos têm se concentrado em um único ponto de tempo ou em uma curta janela de tempo ^{9,10,11,12,13}. Este método de marcação foi emparelhado com a análise de imagens para documentar as mudanças na morfologia do CGN que ocorrem ao longo de todo o curso de tempo da diferenciação do CGN nas primeiras três semanas de vida pós-natal. Esses dados revelam a dinâmica do desenvolvimento de dendritos CGN subjacentes à construção de circuitos cerebelares.