in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究
Summary
ここでは、マウス小脳の顆粒ニューロンがシナプス構造を精緻化し、シナプスを形成して脳回路全体に集積する、生後脳の発達過程におけるシナプス形成を可視化する方法について述べる。
Abstract
神経細胞は、脳の発達中にその構造と機能が動的に変化し、他の細胞と適切な接続を形成します。げっ歯類の小脳は、単一の細胞型である小脳顆粒ニューロン(CGN)の発生と形態形成を経時的に追跡するための理想的なシステムです。ここでは、発達中のマウス小脳における顆粒ニューロン前駆細胞の in vivo エレクトロポレーションを使用して、その後の形態学的分析のために細胞をまばらに標識しました。この技術の有効性は、これらの細胞がシナプス入力の大部分を受け取る特殊な構造である樹状突起爪の形成に特に焦点を当てて、CGN成熟の主要な発達段階を示す能力で実証されています。この技術は、小脳の発達を通してCGNシナプス構造のスナップショットを提供することに加えて、細胞自律的な方法で顆粒ニューロンを遺伝的に操作して、関心のある遺伝子の役割とCGN形態、爪の発達、およびシナプス形成への影響を研究することができます。
Introduction
脳の発達は、胚発生から出生後の生活に及ぶ長期にわたるプロセスです。この間、脳は内因性刺激と外因性刺激の組み合わせを統合し、樹状突起と軸索の間のシナプスの配線を彫刻して最終的に行動を導きます。げっ歯類の小脳は、前駆細胞から成熟ニューロンに移行する際に、単一のニューロンタイプである小脳顆粒ニューロン(CGN)の発達を追跡できるため、シナプスがどのように発達するかを研究するための理想的なモデルシステムです。これは、小脳皮質の大部分が出生後に発達し、出生後の遺伝子操作と細胞標識が容易になるという事実に一部起因しています1。
哺乳類では、CGN分化は、後脳の増殖細胞のサブセットが菱形の唇の上を移動して小脳の表面に二次胚帯を形成する胚発生の終わりに始まります2,3,4。それらは顆粒ニューロン前駆細胞(GNP)の同一性に完全に関与していますが、これらの細胞は生後14日目(P14)まで外部顆粒層(EGL)の外側部分内で増殖し続けます。この層の増殖は、これらの細胞がもっぱらCGNを生じさせるため、小脳の大規模な拡張をもたらします5。生まれたばかりのCGNは、EGLの細胞周期を出ると、内顆粒層(IGL)に向かって内側に移動し、小脳の分子層を分岐して移動する軸索を残し、プルキンエ細胞にシナプスする平行繊維を形成します6。分子層内のこれらの繊維の位置は、細胞周期の出口のタイミングに依存する。
最初に分化したCGNは、分子層の下部に向かって平行な繊維を残しますが、後で分化するCGNの軸索は上部7,8にクラスター化されます。CGN細胞体がIGLに到達すると、樹状突起を精緻化し、近くの抑制性ニューロンおよび興奮性ニューロンとシナプスを形成し始めます。CGNの成熟した樹状木は、4つの主要なプロセスを持つステレオタイプアーキテクチャを示します。CGNの成熟の過程で、これらの樹状突起の末端の構造は、シナプス後タンパク質で濃縮される爪を形成します9,10。樹状突起爪と呼ばれるこれらの特殊な構造は、顆粒ニューロン上のシナプスの大部分を含み、橋に由来する苔状線維神経支配からの興奮性入力と、局所ゴルジ細胞からの抑制性入力の両方を受け取るために重要です。完全に構成されると、CGNのシナプス接続により、これらの細胞は小脳前核からの入力をプルキンエ細胞に中継し、プルキンエ細胞は小脳皮質から深部小脳核に突出します。
GNPのin vivo出生後エレクトロポレーションは、所望の構築物の発現が速いタイムラインで達成でき、この方法は細胞の小さな集団を標的とするため、ウイルス感染やトランスジェニックマウス株の生成などの他の標識ベースの方法よりも有利であり、細胞自律効果の研究に有用である。この方法は、CGNの形態学的発達を研究するための以前の研究で使用されています。ただし、これらの研究は、単一の時点または短い時間枠のいずれかに焦点を当てています9、10、11、12、13。この標識法を画像解析と組み合わせて、生後生後3週間のCGN分化の全時間経過にわたって発生するCGN形態の変化を文書化しました。これらのデータは、小脳回路の構築の根底にあるCGN樹状突起発生のダイナミクスを明らかにしています。
Protocol
Representative Results
Discussion
小脳顆粒ニューロンは、哺乳類の脳で最も豊富なニューロンであり、げっ歯類の脳の全ニューロン集団のほぼ60〜70%を占めています1,14。小脳は、細胞の増殖、遊走、樹状突起形成、シナプス発生のメカニズムの解明に広く利用されています6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH助成金R01NS098804(A.E.W.)、F31NS113394(UC)、およびデューク大学のSummer Neuroscience Program(D.G.)の支援を受けました。
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
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