Gebruik van in vivo postnatale elektroporatie om cerebellaire korrelneuronmorfologie en synapsontwikkeling te bestuderen

Hersenontwikkeling is een langdurig proces dat zich uitstrekt van embryogenese tot postnataal leven. Gedurende deze tijd integreren de hersenen een combinatie van intrinsieke en extrinsieke stimuli die de bedrading van synapsen tussen dendrieten en axonen vormen om uiteindelijk gedrag te sturen. Het cerebellum van knaagdieren is een ideaal modelsysteem om te bestuderen hoe synapsen zich ontwikkelen, omdat de ontwikkeling van een enkel neurontype, het cerebellaire granulaatneuron (CGN), kan worden gevolgd terwijl het overgaat van een voorlopercel naar een volwassen neuron. Dit is deels te wijten aan het feit dat een meerderheid van de cerebellaire cortex zich postnataal ontwikkelt, wat eenvoudige genetische manipulatie en cellabeling na de geboorte mogelijk maakt¹.

Bij zoogdieren begint CGN-differentiatie aan het einde van de embryonale ontwikkeling wanneer een subset van proliferatieve cellen in de achterhersenen over de ruitvormige lip migreert om een secundaire kiemzone op het oppervlak van het cerebellum ^2,3,4 te vormen. Hoewel ze volledig toegewijd zijn aan een korrelneuron voorloper (GNP) identiteit, blijven deze cellen zich vermenigvuldigen in het buitenste deel van de externe korrellaag (EGL) tot postnatale dag 14 (P14). Proliferatie van deze laag resulteert in een enorme uitbreiding van het cerebellum omdat deze cellen uitsluitend aanleiding geven tot CGN’s⁵. Zodra pasgeboren CGN’s de celcyclus in de EGL verlaten, migreren ze naar binnen naar de interne korrellaag (IGL), waarbij ze een axon achterlaten dat zich splitst en reist in de moleculaire laag van het cerebellum, waarbij parallelle vezels worden gevormd die synapseren op Purkinje-cellen⁶. De positie van deze vezels in de moleculaire laag is afhankelijk van de timing van de uitgang van de celcyclus.

CGN’s die differentiëren verlaten eerst hun parallelle vezels naar de onderkant van de moleculaire laag, terwijl de axonen van CGN’s die later differentiëren geclusterd zijn op de bovenste ^7,8. Zodra de CGN-cellichamen de IGL bereiken, beginnen ze dendrieten uit te werken en synapsen te vormen met nabijgelegen remmende en exciterende neuronen. De volwassen dendritische boom van een CGN vertoont een stereotiepe architectuur met vier hoofdprocessen. In de loop van de CGN-rijping vormen de structuren aan het einde van deze dendrieten een klauw die verrijkt wordt met postsynaptische eiwitten ^9,10. Deze gespecialiseerde structuren, dendritische klauwen genoemd, bevatten de meerderheid van de synapsen op korrelneuronen en zijn belangrijk voor het ontvangen van zowel exciterende inputs van mosachtige vezelinnervaties afkomstig van de pons, als remmende inputs van lokale Golgi-cellen. Eenmaal volledig geconfigureerd, stellen de synaptische verbindingen van CGN’s deze cellen in staat om inputs van pre-cerebellaire kernen door te geven aan Purkinje-cellen, die vanuit de cerebellaire cortex naar de diepe cerebellaire kernen projecteren.

In vivo postnatale elektroporatie van BNP’s is voordelig ten opzichte van andere op etikettering gebaseerde methoden, zoals virale infectie en generatie van transgene muislijnen, omdat de expressie van gewenste constructies op een snelle tijdlijn kan worden bereikt en de methode zich richt op een kleine populatie cellen, nuttig bij het bestuderen van celautonome effecten. Deze methode is in eerdere studies gebruikt om de morfologische ontwikkeling van CGN’s te bestuderen; Deze studies hebben zich echter gericht op een enkel tijdstip of een kort tijdvenster 9,10,11,12,13. Deze etiketteringsmethode werd gecombineerd met beeldanalyse om de veranderingen in CGN-morfologie te documenteren die optreden gedurende het gehele tijdsverloop van CGN-differentiatie gedurende de eerste drie weken van het postnatale leven. Deze gegevens onthullen de dynamiek van CGN-dendrietontwikkeling die ten grondslag ligt aan de constructie van cerebellaire circuits.