الاستفادة من التثقيب الكهربائي بعد الولادة في الجسم الحي لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية وتطوير المشبك
Summary
نصف هنا طريقة لتصور تكوين المشابك العصبية الحبيبية في مخيخ الفأر على مدار فترة نمو الدماغ بعد الولادة عندما تقوم هذه الخلايا بتحسين هياكلها المشبكية وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي لدمج نفسها في دائرة الدماغ الكلية.
Abstract
تخضع الخلايا العصبية لتغيرات ديناميكية في بنيتها ووظيفتها أثناء نمو الدماغ لتشكيل روابط مناسبة مع الخلايا الأخرى. مخيخ القوارض هو نظام مثالي لتتبع تطور وتشكل نوع خلية واحدة ، الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية (CGN) ، عبر الزمن. هنا ، تم استخدام التثقيب الكهربائي في الجسم الحي لأسلاف الخلايا العصبية الحبيبية في مخيخ الفأر النامي لتسمية الخلايا بشكل ضئيل للتحليلات المورفولوجية اللاحقة. تتجلى فعالية هذه التقنية في قدرتها على عرض المراحل التنموية الرئيسية لنضج CGN ، مع التركيز بشكل خاص على تكوين المخالب المتغصنة ، وهي هياكل متخصصة حيث تتلقى هذه الخلايا غالبية مدخلاتها المشبكية. بالإضافة إلى توفير لقطات من الهياكل المشبكية CGN طوال تطور المخيخ ، يمكن تكييف هذه التقنية لمعالجة الخلايا العصبية الحبيبية وراثيا بطريقة مستقلة عن الخلية لدراسة دور أي جين مهم وتأثيره على مورفولوجيا CGN ، وتطوير المخلب ، وتكوين المشابك.
Introduction
نمو الدماغ هو عملية طويلة تمتد من التطور الجنيني إلى حياة ما بعد الولادة. خلال هذا الوقت ، يدمج الدماغ مزيجا من المحفزات الداخلية والخارجية التي تنحت أسلاك نقاط الاشتباك العصبي بين الزوائد الشجيرية والمحاور العصبية لتوجيه السلوك في النهاية. مخيخ القوارض هو نظام نموذجي مثالي لدراسة كيفية تطور نقاط الاشتباك العصبي لأن تطور نوع واحد من الخلايا العصبية ، الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية (CGN) ، يمكن تتبعه أثناء انتقاله من خلية سلفية إلى خلية عصبية ناضجة. ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن غالبية القشرة المخيخية تتطور بعد الولادة ، مما يسمح بسهولة التلاعب الجيني ووضع العلامات على الخلايا بعد الولادة1.
في الثدييات ، يبدأ تمايز CGN في نهاية التطور الجنيني عندما تهاجر مجموعة فرعية من الخلايا التكاثرية في الدماغ الخلفي فوق الشفة المعينية لتشكيل منطقة جرثومية ثانوية على سطح المخيخ2،3،4. على الرغم من أنها ملتزمة تماما بهوية السلف العصبي الحبيبي (GNP) ، إلا أن هذه الخلايا تستمر في التكاثر داخل الجزء الخارجي من طبقة الحبيبات الخارجية (EGL) حتى اليوم 14 بعد الولادة (P14). يؤدي تكاثر هذه الطبقة إلى توسع هائل في المخيخ حيث تؤدي هذه الخلايا حصريا إلى CGNs5. بمجرد خروج CGNs حديثي الولادة من دورة الخلية في EGL ، فإنها تهاجر إلى الداخل نحو الطبقة الحبيبية الداخلية (IGL) ، تاركة وراءها محورا عصبيا يتشعب وينتقل في الطبقة الجزيئية للمخيخ ، مكونا أليافا متوازية تتشابك مع خلايا Purkinje6. يعتمد موضع هذه الألياف داخل الطبقة الجزيئية على توقيت خروج دورة الخلية.
تترك CGNs التي تتمايز أولا أليافها المتوازية باتجاه قاع الطبقة الجزيئية ، في حين أن محاور CGNs التي تتمايز لاحقا تتجمع في أعلى 7,8. بمجرد وصول أجسام خلايا CGN إلى IGL ، فإنها تبدأ في وضع التشعبات وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا العصبية المثبطة والمثيرة القريبة. تعرض الشجرة المتغصنة الناضجة ل CGN بنية نمطية مع أربع عمليات رئيسية. على مدار نضوج CGN ، تشكل الهياكل الموجودة في نهاية هذه التشعبات مخلبا يصبح غنيا ببروتينات ما بعد المشبكي 9,10. تحتوي هذه الهياكل المتخصصة ، التي تسمى المخالب المتغصنة ، على غالبية نقاط الاشتباك العصبي على الخلايا العصبية الحبيبية وهي مهمة لتلقي كل من المدخلات المثيرة من تعصيب الألياف الطحلبية الناشئة من الجسور ، وكذلك المدخلات المثبطة من خلايا جولجي المحلية. بمجرد تكوينها بالكامل ، تسمح الوصلات المشبكية ل CGNs لهذه الخلايا بترحيل المدخلات من نوى ما قبل المخيخ إلى خلايا Purkinje ، والتي تخرج من القشرة المخيخية إلى نوى المخيخ العميقة.
في الجسم الحي ، يعد التثقيب الكهربائي بعد الولادة ل GNPs مفيدا على الطرق الأخرى القائمة على وضع العلامات ، مثل العدوى الفيروسية وتوليد خطوط الفئران المعدلة وراثيا ، لأنه يمكن تحقيق التعبير عن التركيبات المرغوبة في جدول زمني سريع ، وتستهدف الطريقة مجموعة صغيرة من الخلايا ، مفيدة في دراسة التأثيرات المستقلة للخلية. وقد استخدمت هذه الطريقة في دراسات سابقة لدراسة التطور المورفولوجي ل CGNs. ومع ذلك ، فقد ركزت هذه الدراسات إما على نقطة زمنية واحدة أو نافذة زمنية قصيرة9،10،11،12،13. تم إقران طريقة وضع العلامات هذه بتحليل الصور لتوثيق التغييرات في مورفولوجيا CGN التي تحدث طوال الدورة الزمنية لتمايز CGN خلال الأسابيع الثلاثة الأولى من حياة ما بعد الولادة. تكشف هذه البيانات عن ديناميكيات تطور تغصنات CGN التي تكمن وراء بناء الدوائر المخيخية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية هي الخلايا العصبية الأكثر وفرة في دماغ الثدييات ، وتشكل ما يقرب من 60-70 ٪ من إجمالي عدد الخلايا العصبية في دماغ القوارض 1,14. تم استخدام المخيخ على نطاق واسع لتوضيح آليات الانتشار الخلوي والهجرة وتكوين التغصنات وتطور المشبك<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01NS098804 (AEW) ، F31NS113394 (U.C.) ، وبرنامج علم الأعصاب الصيفي بجامعة ديوك (D.G.).
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
- Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
- Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
- Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).
- Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
- Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).
- Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
- Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
- Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).
- Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
- Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).
- Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).
- Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
- Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neuroscience. 162 (3), 723-731 (2009).
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
