Использование постнатальной электропорации in vivo для изучения морфологии нейронов мозжечковых гранул и развития синапсов

Развитие мозга – это длительный процесс, который простирается от эмбриогенеза до постнатальной жизни. В течение этого времени мозг интегрирует комбинацию внутренних и внешних стимулов, которые формируют проводку синапсов между дендритами и аксонами, чтобы в конечном итоге направлять поведение. Мозжечок грызунов является идеальной модельной системой для изучения того, как развиваются синапсы, потому что развитие одного типа нейронов, мозжечкового гранулярного нейрона (CGN), можно отслеживать, когда он переходит от клетки-предшественника к зрелому нейрону. Отчасти это связано с тем, что большая часть коры мозжечка развивается постнатально, что позволяет легко проводить генетические манипуляции и маркировку клеток после рождения¹.

У млекопитающих дифференцировка CGN начинается в конце эмбрионального развития, когда подмножество пролиферативных клеток в заднем мозге мигрирует через ромбическую губу, образуя вторичную зародышевую зону на поверхности мозжечка ^2,3,4. Несмотря на то, что они полностью привержены идентичности предшественника гранулярных нейронов (GNP), эти клетки продолжают пролиферировать во внешней части внешнего слоя гранул (EGL) до 14-го дня после рождения (P14). Пролиферация этого слоя приводит к массивному расширению мозжечка, поскольку эти клетки дают начало исключительно CGN⁵. Как только новорожденные CGN выходят из клеточного цикла в EGL, они мигрируют внутрь к внутреннему слою гранул (IGL), оставляя после себя аксон, который раздваивается и перемещается в молекулярном слое мозжечка, образуя параллельные волокна, которые синапсы на клетках Пуркинье⁶. Положение этих волокон в молекулярном слое зависит от времени выхода из клеточного цикла.

CGN, которые дифференцируются первыми, оставляют свои параллельные волокна к нижней части молекулярного слоя, тогда как аксоны CGN, которые дифференцируются позже, группируются в верхней^{части 7,8}. Как только клеточные тела CGN достигают IGL, они начинают развивать дендриты и образовывать синапсы с близлежащими тормозными и возбуждающими нейронами. Зрелое дендритное дерево CGN демонстрирует стереотипную архитектуру с четырьмя основными процессами. В ходе созревания CGN структуры на концах этих дендритов образуют коготь, который обогащается постсинаптическими белками ^9,10. Эти специализированные структуры, называемые дендритными когтями, содержат большинство синапсов на гранулярных нейронах и важны для получения как возбуждающих входов от иннерваций мшистых волокон, происходящих из моста, так и ингибирующих входов от местных клеток Гольджи. После полной настройки синаптические связи CGN позволяют этим клеткам передавать входные сигналы от предмозжечковых ядер к клеткам Пуркинье, которые проецируются из коры мозжечка в глубокие ядра мозжечка.

Постнатальная электропорация GNP in vivo является преимуществом по сравнению с другими методами, основанными на маркировке, такими как вирусная инфекция и генерация трансгенных линий мышей, поскольку экспрессия желаемых конструкций может быть достигнута в короткие сроки, и метод нацелен на небольшую популяцию клеток, что полезно для изучения клеточно-автономных эффектов. Этот метод использовался в предыдущих исследованиях для изучения морфологического развития CGN; Однако эти исследования были сосредоточены либо на одном моменте времени, либо на коротком промежутке времени 9,10,11,12,13. Этот метод маркировки был сопряжен с анализом изображений для документирования изменений в морфологии CGN, которые происходят на протяжении всего периода дифференцировки CGN в течение первых трех недель постнатальной жизни. Эти данные раскрывают динамику развития дендритов CGN, лежащих в основе построения мозжечковых контуров.