Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi

Lo sviluppo del cervello è un processo prolungato che si estende dall’embriogenesi alla vita postnatale. Durante questo periodo, il cervello integra una combinazione di stimoli intrinseci ed estrinseci che scolpiscono il cablaggio delle sinapsi tra dendriti e assoni per guidare in definitiva il comportamento. Il cervelletto dei roditori è un sistema modello ideale per studiare come si sviluppano le sinapsi perché lo sviluppo di un singolo tipo di neurone, il neurone granulo cerebellare (CGN), può essere monitorato mentre passa da una cellula progenitrice a un neurone maturo. Ciò è dovuto, in parte, al fatto che la maggior parte della corteccia cerebellare si sviluppa postnatale, il che consente una facile manipolazione genetica e l’etichettatura cellulare dopo la nascita¹.

Nei mammiferi, la differenziazione CGN inizia alla fine dello sviluppo embrionale quando un sottogruppo di cellule proliferative nel cervello posteriore migra sul labbro rombico per formare una zona germinale secondaria sulla superficie del cervelletto ^2,3,4. Sebbene siano pienamente impegnate in un’identità progenitrice del neurone granulo (GNP), queste cellule continuano a proliferare all’interno della porzione esterna dello strato granulo esterno (EGL) fino al giorno 14 postnatale (P14). La proliferazione di questo strato provoca una massiccia espansione del cervelletto poiché queste cellule danno origine esclusivamente a CGN⁵. Una volta che i CGN appena nati escono dal ciclo cellulare nell’EGL, migrano verso l’interno verso lo strato di granuli interni (IGL), lasciandosi dietro un assone che si biforcherà e viaggerà nello strato molecolare del cervelletto, formando fibre parallele che sinapsi sulle cellule di Purkinje⁶. La posizione di queste fibre all’interno dello strato molecolare dipende dai tempi di uscita del ciclo cellulare.

I CGN che si differenziano per primi lasciano le loro fibre parallele verso il fondo dello strato molecolare, mentre gli assoni dei CGN che si differenziano in seguito sono raggruppati nella parte superiore ^7,8. Una volta che i corpi delle cellule CGN raggiungono l’IGL, iniziano a elaborare dendriti e formano sinapsi con i vicini neuroni inibitori ed eccitatori. L’albero dendritico maturo di un CGN mostra un’architettura stereotipata con quattro processi principali. Nel corso della maturazione di CGN, le strutture alla fine di questi dendriti formano un artiglio che si arricchisce di proteine postsinaptiche ^9,10. Queste strutture specializzate, chiamate artigli dendritici, contengono la maggior parte delle sinapsi sui neuroni granuli e sono importanti per ricevere sia input eccitatori da innervazioni di fibre muschiose provenienti dal ponte, sia input inibitori dalle cellule locali di Golgi. Una volta completamente configurate, le connessioni sinaptiche delle CGN consentono a queste cellule di trasmettere input dai nuclei pre-cerebellari alle cellule di Purkinje, che si proiettano dalla corteccia cerebellare ai nuclei cerebellari profondi.

L’elettroporazione postnatale in vivo dei PNL è vantaggiosa rispetto ad altri metodi basati sulla marcatura, come l’infezione virale e la generazione di linee di topo transgeniche, perché l’espressione dei costrutti desiderati può essere raggiunta su una linea temporale rapida e il metodo si rivolge a una piccola popolazione di cellule, utile nello studio degli effetti autonomi delle cellule. Questo metodo è stato utilizzato in studi precedenti per studiare lo sviluppo morfologico delle CGN; Tuttavia, questi studi si sono concentrati su un singolo punto temporale o su una breve finestra temporale 9,10,11,12,13. Questo metodo di etichettatura è stato abbinato all’analisi delle immagini per documentare i cambiamenti nella morfologia CGN che si verificano durante l’intero corso della differenziazione CGN nelle prime tre settimane di vita postnatale. Questi dati rivelano le dinamiche dello sviluppo di dendriti CGN che sono alla base della costruzione dei circuiti cerebellari.