Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması

Beyin gelişimi, embriyogenezden doğum sonrası yaşama kadar uzanan uzun bir süreçtir. Bu süre zarfında beyin, sonuçta davranışı yönlendirmek için dendritler ve aksonlar arasındaki sinapsların kablolamasını şekillendiren içsel ve dışsal uyaranların bir kombinasyonunu bütünleştirir. Kemirgen beyinciği, sinapsların nasıl geliştiğini incelemek için ideal bir model sistemidir, çünkü tek bir nöron tipi olan serebellar granül nöronun (CGN) gelişimi, bir progenitör hücreden olgun bir nörona geçerken izlenebilir. Bu, kısmen, serebellar korteksin çoğunluğunun doğum sonrası gelişmesinden kaynaklanmaktadır, bu da doğumdan sonra kolay genetik manipülasyona ve hücre etiketlemesine izin verir¹.

Memelilerde, CGN farklılaşması, embriyonik gelişimin sonunda, arka beyindeki proliferatif hücrelerin bir alt kümesinin, beyincik^yüzeyinde ikincil bir germinal bölge oluşturmak için eşkenar dörtgen dudağın üzerinden göç etmesiyle başlar ^2,3,4. Granül nöron progenitör (GSMH) kimliğine tamamen bağlı olmalarına rağmen, bu hücreler doğum sonrası 14. güne (P14) kadar dış granül tabakasının (EGL) dış kısmında çoğalmaya devam ederler. Bu tabakanın çoğalması, beyinciğin büyük ölçüde genişlemesine neden olur, çünkü bu hücreler sadece CGN^5’e yol açar. Yenidoğan CGN’ler EGL’deki hücre döngüsünden çıktıktan sonra, iç granül tabakasına (IGL) doğru içe doğru göç ederler ve beyinciğin moleküler tabakasında çatallanacak ve hareket edecek bir akson bırakarak Purkinje hücrelerine sinaps yapan paralel lifler oluştururlar⁶. Bu liflerin moleküler tabaka içindeki konumu, hücre döngüsü çıkışının zamanlamasına bağlıdır.

Farklılaşan CGN’ler önce paralel liflerini moleküler tabakanın altına doğru bırakırken, daha sonra farklılaşan CGN’lerin aksonları ilk ^7,8’de kümelenir. CGN hücre gövdeleri IGL’ye ulaştığında, dendritleri detaylandırmaya ve yakındaki inhibitör ve uyarıcı nöronlarla sinapslar oluşturmaya başlarlar. Bir CGN’nin olgun dendritik ağacı, dört ana süreçle kalıplaşmış bir mimari sergiler. CGN olgunlaşması boyunca, bu dendritlerin sonundaki yapılar, postsinaptik proteinlerle zenginleştirilmiş bir pençe oluşturur ^9,10. Dendritik pençeler olarak adlandırılan bu özel yapılar, sinapsların çoğunu granül nöronlar üzerinde içerir ve hem pons’tan kaynaklanan yosunlu lif innervasyonlarından uyarıcı girdileri hem de lokal Golgi hücrelerinden inhibitör girdileri almak için önemlidir. Tamamen yapılandırıldıktan sonra, CGN’lerin sinaptik bağlantıları, bu hücrelerin pre-serebellar çekirdeklerden gelen girdileri, serebellar korteksten derin serebellar çekirdeklere yansıtan Purkinje hücrelerine aktarmasına izin verir.

GSMH’lerin doğum sonrası in vivo elektroporasyonu, viral enfeksiyon ve transgenik fare çizgilerinin üretilmesi gibi diğer etiketleme tabanlı yöntemlere göre avantajlıdır, çünkü istenen yapıların ekspresyonu hızlı bir zaman çizelgesinde elde edilebilir ve yöntem, hücre özerk etkilerini incelemede yararlı olan küçük bir hücre popülasyonunu hedefler. Bu yöntem, CGN’lerin morfolojik gelişimini incelemek için önceki çalışmalarda kullanılmıştır; Bununla birlikte, bu çalışmalar ya tek bir zaman noktasına ya da kısa bir zaman penceresine odaklanmıştır 9,10,11,12,13. Bu etiketleme yöntemi, doğum sonrası yaşamın ilk üç haftasında CGN farklılaşmasının tüm zaman seyri boyunca meydana gelen CGN morfolojisindeki değişiklikleri belgelemek için görüntü analizi ile eşleştirildi. Bu veriler, serebellar devrelerin yapımının altında yatan CGN dendrit gelişiminin dinamiklerini ortaya koymaktadır.