نهج الذكاء الاصطناعي لتقييم سيليا الأولية
Summary
يظهر استخدام الذكاء الاصطناعي (Ai) لتحليل الصور كنهج قوي وأقل تحيزا وسريعا مقارنة بالطرق الشائعة الاستخدام. هنا قمنا بتدريب Ai على التعرف على العضية الخلوية ، أهداب أساسي ، وتحليل خصائص مثل الطول وكثافة التلطيخ بطريقة صارمة وقابلة للاستنساخ.
Abstract
سيليا هي الزوائد الخلوية القائمة على microtubule التي تعمل كمراكز إشارات لتنويع مسارات الإشارات في العديد من أنواع خلايا الثدييات. يتم الحفاظ على طول سيليا للغاية ، وينظم بإحكام ، ويختلف بين أنواع الخلايا المختلفة والأنسجة ، وقد تورط في التأثير المباشر على قدرتها على الإشارة. على سبيل المثال، وقد ثبت أهداب لتغيير أطوالها استجابة لتفعيل مستقبلات البروتين Ciliary G مقرونة. ومع ذلك ، فإن قياس أطوال الأهداب بشكل دقيق ومستنسخ هو إجراء يستغرق وقتا طويلا وكثيف العمالة. كما أن النهج الحالية عرضة للخطأ والتحيز. يمكن استخدام برامج الذكاء الاصطناعي (Ai) للتغلب على العديد من هذه التحديات بسبب القدرات التي تسمح بالاستيعاب والتلاعب والتحسين من مجموعات البيانات الواسعة النطاق. هنا، نثبت أنه يمكن تدريب وحدة الذكاء الاصطناعي على التعرف على أهداب في الصور من كل من عينات الجسم الحي وفي المختبر. بعد استخدام الذكاء الاصطناعي المدرب لتحديد أهداب، ونحن قادرون على تصميم والاستفادة بسرعة التطبيقات التي تحلل مئات من أهداب في عينة واحدة لطول وكثافة مضان والتوطين المشترك. هذا النهج غير المتحيز زاد من ثقتنا وصرامة عند مقارنة عينات من الإعدادية العصبية الأولية المختلفة في المختبر وكذلك عبر مناطق الدماغ المختلفة داخل الحيوان وبين الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لتحليل موثوق به ديناميات أهداب من أي نوع الخلية والأنسجة بطريقة عالية الإنتاجية عبر عينات متعددة ومجموعات العلاج. وفي نهاية المطاف، من المرجح أن تصبح النهج القائمة على الذكاء الاصطناعي قياسية مع تحرك معظم المجالات نحو نهج أقل تحيزا وأكثر قابلية للاستنساخ للحصول على الصور وتحليلها.
Introduction
أهداب الأولية هي العضيات الحسية جاحظ من معظم أنواع الخلايا الثديية1،2،3،4. هم عموما الزوائد الانفرادي حاسمة لتنسيق مسارات إشارات الخلية المتنوعة عن طريق دمج إشارات خارج الخلية5,6,7. تلعب أهداب الأولية أدوارا هامة أثناء النمو الجنيني وداء التوازن الأنسجة الكبار، ويرتبط تعطيل وظيفتها أو مورفولوجيا مع العديد من الاضطرابات الوراثية، والتي تسمى مجتمعة اعتلالات الكظر. نظرا لطبيعة شبه موجودة في كل مكان من أهداب، ترتبط اعتلالات السيليوباثية مع مجموعة واسعة من الميزات السريرية التي يمكن أن تؤثر على جميع أنظمة الجهاز8،9،10،11،12. في النماذج الحيوانية من اعتلالات الكظر، وفقدان بنية السيلاري أو قدرة الإشارات يتجلى في العديد من الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا بما في ذلك السمنة المرتبطة hyperphagia3،13،14،15. في العديد من أنظمة النموذج، وقد ثبت تغييرات طول أهداب للتأثير على قدرتها على الإشارات ووظائف16،17،18،19. ومع ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية التي تستغرق وقتا طويلا المرتبطة بدقة واستنساخ تقييم طولilia وتكوينها.
الجهاز العصبي المركزي للثدييات البالغة (CNS) هو سياق بيولوجي واحد شكل تحديا لفهم مورفولوجيا ووظيفة أهداب. في حين يبدو أن الخلايا العصبية والخلايا في جميع أنحاء CNS تمتلك أهداب, نظرا لأدوات محدودة وقدرات على مراقبة وتحليل هذه أهداب فهم وظائفها لا يزال بعيد المنال20. على سبيل المثال، فإن علامة أهداب نموذجية، أسيتيلاتيد α-توبولين، لا تسمية أهداب الخلايا العصبية20. تم حل صعوبة دراسة هذه الأهداب جزئيا مع اكتشاف العديد من مستقبلات البروتين G المقترنة (GPCR) ، مما يشير إلى الآلات والبروتينات المرتبطة بالغشاء التي يتم تخصيبها على غشاء أهداب الخلايا العصبية21،22. كل هذه الملاحظات الأساسية المباشرة تشير إلى أهمية وتنوع سيليا CNS ، والتي تبدو حتى الآن لا مثيل لها من قبل الأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، يمكن ملاحظة الاختلاف في طول أهداب وتوطين GPCR في جميع أنحاء الدماغ، مع أطوال في بعض النوى العصبية يجري مختلفة بالمقارنة مع نواة أخرى19،23. وبالمثل، فإن محتوى GPCR ومجاملة آلات الإشارة تظهر التنوع على أساس الموقع التشريحي العصبي ونوع الخلايا العصبية2،24،25،26،27،28،29. هذه الملاحظات البسيطة تثبت أن طول الثدييات CNS أهداب وتكوينها ينظم بإحكام، تماما كما هو الحال في الكائنات الحية النموذجية، مثل الكلاميدوموناس راينهارتي،ولكن تأثير هذه الاختلافات طول على وظيفة أهداب، والإشارات والسلوك في نهاية المطاف لا يزال غير واضح16،30،31،32.
قياس بدقة طول أهداب وتكوين يثبت أن يكون تحديا تقنيا عرضة لخطأ المستخدم وعدم القابلية للإلغاء. حاليا يتم تحديد أهداب في الجسم الحي وفي المختبر في معظم الأحيان باستخدام النهج immunofluorescent التي تسمية البروتينات السيلاري أو السيليه المخصب مراسل الفلورسنت أليليس33،34،35. ثم يتم قياس أطوال هذه أهداب الموسومة فلوريا من صورة ثنائية الأبعاد (2D) باستخدام أدوات قياس الخط في برامج تحليل الصور مثل ImageJ36. هذه العملية ليست مملة وكثيفة العمالة فحسب ، بل هي أيضا عرضة للتحيز والخطأ. تنشأ هذه العقبات نفسها عند قياس كثافة أهداب ، والتي تساعد على الإشارة إلى التغيرات في هيكل أهداب37. للحد من التناقضات في هذه الأنواع من تحليلات الصور ، أصبحت برامج الذكاء الاصطناعي (Ai) أكثر انتشارا وبأسعار معقولة خيارات38.
منظمة العفو الدولية هو التقدم في أنظمة الكمبيوتر التي تستخدم ميزة خوارزميات الكمبيوتر والبرمجة لتنفيذ المهام التي تتطلب عادة الذكاء البشري39. يتم تعليم أجهزة الذكاء الاصطناعي إدراك الأنماط والمعلمات والخصائص المتكررة واتخاذ إجراءات لزيادة احتمالات تحقيق نتائج ناجحة إلى أقصى حد. الذكاء الاصطناعي متعدد الاستخدامات ويمكن تدريبه على التعرف على كائنات أو هياكل محددة ذات أهمية ، مثل أهداب ، ومن ثم برمجتها لتشغيل مجموعة متنوعة من التحليلات على الأشياء المحددة. لذلك ، يمكن إنشاء بيانات الصور المعقدة بسرعة وبصورة مستنسخة بواسطة Ai38. سوف الأتمتة وتحليل الذكاء الاصطناعي من الصور الملتقطة زيادة الفعالية والكفاءة مع الحد من أي خطأ بشري محتمل والتحيز39. إنشاء منهجية تستند إلى الذكاء الاصطناعي لتحديد أهداب يخلق طريقة متسقة لجميع مجموعات البحوث لتحليل وتفسير بيانات أهداب.
هنا نستخدم وحدة الذكاء الاصطناعي لتحديد أهداب في الجسم الحي وفي المختبر على الصور 2D. باستخدام مجموعة من الصور عينة يتم تدريب منظمة العفو الدولية لتحديد أهداب. بمجرد الانتهاء من التدريب ، يتم استخدام الذكاء الاصطناعي المعين لتطبيق قناع ثنائي على أهداب التعرف على Ai في صورة. الثنائيات التي تطبقها منظمة العفو الدولية قابلة للتعديل، إذا لزم الأمر، لضمان التعرف على جميع أهداب في الصور بشكل صحيح ويتم القضاء على تحديد الهوية غير محددة. بعد استخدام الذكاء الاصطناعي لتحديد أهداب، يتم استخدام برامج التحليل العام (GA) المصممة خصيصا لإجراء تحليلات مختلفة مثل قياس طول أهداب وكثافة الفلورسينس. يتم تصدير البيانات التي تم جمعها إلى جدول يمكن قراءته وتفسيره واستخدامه بسهولة في التحليلات الإحصائية(الشكل 1). استخدام التكنولوجيا الآلية والذكاء الاصطناعي لتحديد أهداب والحصول على قياسات محددة بين المجموعات التجريبية سوف تساعد في الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى فهم تأثير وظيفة سيه سيز سيليا ومورفولوجيا على الاتصالات الخلوية الخلية والسلوك.
Protocol
Representative Results
Discussion
قياسات الطول والكثافة هي طرق شائعة يتم تحليل أهداب الأولية، ومع ذلك، لا توجد طريقة تقليدية موحدة المستخدمة في هذا المجال. تحديد وتكميم أهداب الأولية باستخدام برامج مثل ImageJ هو مضيعة للوقت وعرضة للتحيز المستخدم والخطأ. وهذا يجعل من الصعب تحليل مجموعات البيانات الكبيرة بدقة. هنا نظهر أن استخدام برنامج الذكاء الاصطناعي يمكن التغلب على العديد من هذه التحديات مما يجعل تحليل الإنتاجية العالية من أهداب الأولية قابلة للتحقيق. هنا نحن وصف الإجراء لتدريب تطبيق على أساس الذكاء الاصطناعي للتعرف على أهداب الأولية وتحديد الخطوات اللازمة لتحليل الطول والكثافة.
في حين أن التدريب الأولي للذكاء الاصطناعي للتعرف على أهداب يتطلب وقتا كبيرا من المستخدم، وبمجرد الانتهاء من ذلك يمكن استخدامه على أي مجموعة بيانات المكتسبة مع نفس المعلمات. القناع الثنائي الذي تم إنشاؤه بواسطة Ai قابل للتعديل بحيث يمكن تصحيح أي أخطاء. ومع ذلك ، يجب أن تشير الأخطاء في تحديد أهداب المستخدم إلى أن الذكاء الاصطناعي يحتاج إلى مزيد من التدريب مع صور إضافية. إحدى المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن تدريب الذكاء الاصطناعي على التعرف على الأهداب في أنواع عينات مختلفة في كل من 2D و 3D. أساليب التحليل السابقة المتولدة داخل المختبرات لها قيود مختلفة بما في ذلك تتطلب العتبة اليدوية لتحديد الهوية ومشاكل في تحديد أهداب مصورة من أقسام الأنسجة حيث كثافة الخلية عالية36،46،47. هذه الأساليب متخصصة أيضا في تحليل أهداب بينما التحليل باستخدام برنامج NIS Elements يمكن أن يقيم عدة جوانب من الصور في وقت واحد. لأن منظمة العفو الدولية الموصوفة هنا هو جزء من حزمة برامج عناصر NIS ، يمكن بسهولة استمرار الصور المكتسبة باستخدام مجهر نيكون من خلال التحليل. ومع ذلك ، التصوير مع نيكون ليست مطلوبة لاستخدام هذه الطريقة. بغض النظر عن تنسيق ملف البيانات الأولية الملتقطة، يمكن فتح ملفات “.tif” بواسطة عناصر NIS لاستخدامها في Ai.
هذا التطبيق منظمة العفو الدولية ضمن عناصر NIS متاحة على نطاق واسع، وربما بالفعل جزءا من برنامج تحليل الصور المستخدمة من قبل مختبرات دراسة أهداب الأولية. مع توسع انتشار تقنية الذكاء الاصطناعي ، قد توسع برامج التصوير الأخرى خيارات التحليل الخاصة بها لتشمل وحدة Ai مماثلة. يمكن استخدام تطبيق تحليل الذكاء الاصطناعي على تعريف أهداب لعدة جوانب مختلفة من تحليل أهداب. بينما حددنا طرق لبعض التحليلات البسيطة مثل الطول (الشكل 2 و 3) ، يمكن إضافة الكثافة (الشكل 4) والتكسير(الشكل 5)إلى سير عمل تحليل GA3 كما هو الحال في الشكل 6. فعلى سبيل المثال، بدلا من قياس كثافة السيليوم الكامل، قد تكون الاختلافات في الكثافة داخل منطقة فرعية من السيليوم ذات أهمية لتقييم التعريب دون الوسطي. الاختلافات في كثافة داخل منطقة دون إقليمية من السيليوم يمكن أن تشير إلى البروتين يتراكم في طرف أو قاعدة السيليوم، مثل كيفية إثراء البروتينات غلي في غيض من أهداب48. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تطبيق الذكاء الاصطناعي هذا لتحديد الاختلافات بسهولة بين الأنماط الجينية أو مجموعات العلاج. في حين أن مختبرنا يستخدم هذه الطريقة في المقام الأول لتحليل أهداب مصورة من أقسام الدماغ أو الثقافات العصبية ، يمكن تطبيقه على الصور المكتسبة من خطوط الخلايا المختلفة أو أنواع الأنسجة الأخرى. مرونة نوع العينة التي يمكن استخدام هذا التطبيق على يجعل هذه الطريقة من التحليل قيمة لكثير من المجموعات المختلفة دراسة أهداب الأولية أو أي العضية المنفصلة التي يجري تقييمها مثل الميتوكوندريا, نواة, أو ER.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى R01 DK114008 إلى NFB ومنحة زمالة جمعية القلب الأمريكية #18PRE34020122 إلى RB. نشكر ريتش جروسكين المدير العام لبرامج نيكون، ميليسا بنتلي، كورتني هايكرافت وتيريزا ماستراتشي على تعليقاتهم الثاقبة على المخطوطة.
Materials
| Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM | Intel Corporation | W-2123 | Processor used for running NIS Elements. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments Inc. | – | Ai and GA3 software |
| Quadro RTX 4000 Graphics card | NVIDIA Corporation | Quadro RTX 4000 | |
| Windows 10 Professional 64-bit | Microsoft Inc. | – | Operating system used for running NIS Elements |
| Workstation | HP Development Company, L.P. | HP Z4G4 | Workstation used for running NIS Elements |
References
- Wang, L., et al. Ciliary gene RPGRIP1L is required for hypothalamic arcuate neuron development. JCI Insight. 4 (3), (2019).
- Siljee, J. E., et al. Subcellular localization of MC4R with ADCY3 at neuronal primary cilia underlies a common pathway for genetic predisposition to obesity. Nature Genetics. 50 (2), 180-185 (2018).
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Current Biology. 17 (18), 1586-1594 (2007).
- Berbari, N. F., O’Connor, A. K., Haycraft, C. J., Yoder, B. K. The primary cilium as a complex signaling center. Current Biology. 19 (13), 526-535 (2009).
- Walz, G. Role of primary cilia in non-dividing and post-mitotic cells. Cell Tissue Research. 369 (1), 11-25 (2017).
- Nachury, M. V., Mick, D. U. Establishing and regulating the composition of cilia for signal transduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (7), 389-405 (2019).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Engle, S. E., Bansal, R., Antonellis, P. J., Berbari, N. F. Cilia signaling and obesity. Seminars in Cell and Developmental Biology. , (2020).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatric Nephrology. 26 (7), 1039-1056 (2011).
- Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. New England Journal of Medicine. 364 (16), 1533-1543 (2011).
- Vaisse, C., Reiter, J. F., Berbari, N. F. Cilia and Obesity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), (2017).
- Berbari, N. F., et al. Leptin resistance is a secondary consequence of the obesity in ciliopathy mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), 7796-7801 (2013).
- Jacobs, D. T., et al. Dysfunction of intraflagellar transport-A causes hyperphagia-induced obesity and metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 789-798 (2016).
- Arsov, T., et al. Fat aussie–a new Alström syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis. Molecular Endocrinology. 20 (7), 1610-1622 (2006).
- Tam, L. W., Ranum, P. T., Lefebvre, P. A. CDKL5 regulates flagellar length and localizes to the base of the flagella in Chlamydomonas. Molecular Biology of the Cell. 24 (5), 588-600 (2013).
- Rajagopalan, V., Subramanian, A., Wilkes, D. E., Pennock, D. G., Asai, D. J. Dynein-2 affects the regulation of ciliary length but is not required for ciliogenesis in Tetrahymena thermophila. Molecular Biology of the Cell. 20 (2), 708-720 (2009).
- Bengs, F., Scholz, A., Kuhn, D., Wiese, M. LmxMPK9, a mitogen-activated protein kinase homologue affects flagellar length in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology. 55 (5), 1606-1615 (2005).
- Han, Y. M., et al. Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2193-2197 (2014).
- Caspary, T., Marazziti, D., Berbari, N. F., Satir, P., Tvorup Christensen, S. . Cilia: Methods and Protocols. , 203-214 (2016).
- Bishop, G. A., Berbari, N. F., Lewis, J., Mykytyn, K. Type III adenylyl cyclase localizes to primary cilia throughout the adult mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 505 (5), 562-571 (2007).
- Domire, J. S., Mykytyn, K. Markers for neuronal cilia. Methods in Cell Biology. 91, 111-121 (2009).
- Sun, J. S., et al. Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), (2021).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Research. 872 (1-2), 271-275 (2000).
- Domire, J. S., et al. Dopamine receptor 1 localizes to neuronal cilia in a dynamic process that requires the Bardet-Biedl syndrome proteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (17), 2951-2960 (2011).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89 (3), 909-926 (1999).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), 10335-10340 (2014).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
- Berman, S. A., Wilson, N. F., Haas, N. A., Lefebvre, P. A. A novel MAP kinase regulates flagellar length in Chlamydomonas. Current Biology. 13 (13), 1145-1149 (2003).
- Nguyen, R. L., Tam, L. W., Lefebvre, P. A. The LF1 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a novel protein required for flagellar length control. Genetics. 169 (3), 1415-1424 (2005).
- Tam, L. W., Wilson, N. F., Lefebvre, P. A. A CDK-related kinase regulates the length and assembly of flagella in Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 176 (6), 819-829 (2007).
- O’Connor, A. K., et al. An inducible CiliaGFP mouse model for in vivo visualization and analysis of cilia in live tissue. Cilia. 2 (1), 8 (2013).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
- Delling, M., et al. Primary cilia are not calcium-responsive mechanosensors. Nature. 531 (7596), 656-660 (2016).
- Saggese, T., Young, A. A., Huang, C., Braeckmans, K., McGlashan, S. R. Development of a method for the measurement of primary cilia length in 3D. Cilia. 1 (1), 11 (2012).
- Kobayashi, Y., Hamamoto, A., Saito, Y. Analysis of ciliary status via G-protein-coupled receptors localized on primary cilia. Microscopy. 69 (5), 277-285 (2020).
- Zhou, L. Q., et al. Artificial intelligence in medical imaging of the liver. World Journal of Gastroenterology. 25 (6), 672-682 (2019).
- Naugler, C., Church, D. L. Automation and artificial intelligence in the clinical laboratory. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 56 (2), 98-110 (2019).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Bansal, R., et al. Hedgehog Pathway Activation Alters Ciliary Signaling in Primary Hypothalamic Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 266 (2019).
- Jin, H., et al. The conserved Bardet-Biedl syndrome proteins assemble a coat that traffics membrane proteins to cilia. Cell. 141 (7), 1208-1219 (2010).
- Liew, G. M., et al. The intraflagellar transport protein IFT27 promotes BBSome exit from cilia through the GTPase ARL6/BBS3. Developmental Cell. 31 (3), 265-278 (2014).
- Engle, S. E., et al. A CreER Mouse to Study Melanin Concentrating Hormone Signaling in the Developing Brain. Genesis. , (2018).
- Thorpe, S. D., et al. Reduced primary cilia length and altered Arl13b expression are associated with deregulated chondrocyte Hedgehog signaling in alkaptonuria. Journal of Cellular Physiology. 232 (9), 2407-2417 (2017).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8, 1 (2019).
- Dummer, A., Poelma, C., DeRuiter, M. C., Goumans, M. J., Hierck, B. P. Measuring the primary cilium length: improved method for unbiased high-throughput analysis. Cilia. 5, 7 (2016).
- Haycraft, C. J., et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genetics. 1 (4), 53 (2005).
