Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen
Summary
Het gebruik van kunstmatige intelligentie (Ai) om beelden te analyseren is in opkomst als een krachtige, minder bevooroordeelde en snelle aanpak in vergelijking met veelgebruikte methoden. Hier hebben we Ai getraind om een cellulair organel, primaire trilharen te herkennen en eigenschappen zoals lengte en kleurintensiteit op een rigoureuze en reproduceerbare manier te analyseren.
Abstract
Trilharen zijn op microtubuli gebaseerde cellulaire aanhangsels die functioneren als signaleringscentra voor een verscheidenheid aan signaalroutes in veel zoogdierceltypen. De lengte van trilharen is sterk geconserveerd, strak gereguleerd en varieert tussen verschillende celtypen en weefsels en is betrokken bij het direct beïnvloeden van hun signaalcapaciteit. Van trilharen is bijvoorbeeld aangetoond dat ze hun lengte veranderen als reactie op activering van ciliaire G-eiwitgekoppelde receptoren. Het nauwkeurig en reproduceerbaar meten van de lengte van talrijke trilharen is echter een tijdrovende en arbeidsintensieve procedure. De huidige benaderingen zijn ook fout- en vooringenomenheidsgevoelig. Kunstmatige intelligentie (Ai) -programma’s kunnen worden gebruikt om veel van deze uitdagingen te overwinnen vanwege mogelijkheden die assimilatie, manipulatie en optimalisatie van uitgebreide datasets mogelijk maken. Hier laten we zien dat een Ai-module getraind kan worden om trilharen te herkennen in beelden van zowel in vivo als in vitro monsters. Na het gebruik van de getrainde Ai om trilharen te identificeren, zijn we in staat om toepassingen te ontwerpen en snel te gebruiken die honderden trilharen in één monster analyseren op lengte, fluorescentie-intensiteit en co-lokalisatie. Deze onbevooroordeelde benadering verhoogde ons vertrouwen en onze strengheid bij het vergelijken van monsters van verschillende primaire neuronale preps in vitro en in verschillende hersengebieden binnen een dier en tussen dieren. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om de trilharendynamiek van elk celtype en weefsel betrouwbaar te analyseren op een high-throughput manier over meerdere monsters en behandelingsgroepen. Uiteindelijk zullen ai-gebaseerde benaderingen waarschijnlijk standaard worden, omdat de meeste velden evolueren naar minder bevooroordeelde en meer reproduceerbare benaderingen voor beeldacquisitie en -analyse.
Introduction
Primaire trilharen zijn sensorische organellen die uitsteken uit de meeste zoogdierceltypen1,2,3,4. Het zijn over het algemeen solitaire aanhangsels die cruciaal zijn voor het coördineren van diverse celsignaleringsroutes door extracellulairesignalen 5,6,7te integreren. Primaire trilharen spelen een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en de homeostase van volwassen weefsel, en verstoring van hun functie of morfologie wordt geassocieerd met verschillende genetische aandoeningen, die gezamenlijk ciliopathieën worden genoemd. Vanwege de bijna alomtegenwoordige aard van trilharen, worden ciliopathieën geassocieerd met een breed scala aan klinische kenmerken die van invloed kunnen zijn op alle orgaansystemen8,9,10,11,12. In diermodellen van ciliopathieën manifesteert verlies van ciliaire structuur of signaleringscapaciteit zich in verschillende klinisch relevante fenotypen, waaronder hyperfagie-geassocieerde obesitas3,13,14,15. In veel modelsystemen is aangetoond dat veranderingen in de lengte van trilharen van invloed zijn op hun signaleringscapaciteit en functies16,17,18,19. Er zijn echter verschillende tijdrovende en technische uitdagingen verbonden aan het nauwkeurig en reproduceerbaar beoordelen van de lengte en samenstelling van trilharen.
Het volwassen centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CZS) is een biologische context die een uitdaging heeft gevormd voor het begrijpen van de morfologie en functie van trilharen. Hoewel het erop lijkt dat neuronen en cellen in het hele CZS trilharen bezitten, blijft vanwege de beperkte hulpmiddelen en mogelijkheden om deze trilharen te observeren en te analyseren een begrip van hun functies ongrijpbaar20. Bijvoorbeeld, de prototypische cilia marker, geacetyleerd α-tubuline, labelt geen neuronale cilia20. De moeilijkheid van het bestuderen van deze trilharen werd gedeeltelijk opgelost met de ontdekking van verschillende G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR), signaleringsmachines en membraangeassocieerde eiwitten die zijn verrijkt op het membraan van neuronale trilharen21,22. Al deze eenvoudige basiswaarnemingen wijzen op het belang en de diversiteit van CZS-trilharen, die tot nu toe ongeëvenaard lijken door andere weefsels. Variatie in trilharenlengte en GPCR-lokalisatie kan bijvoorbeeld in de hele hersenen worden waargenomen, waarbij lengtes in bepaalde neuronale kernen anders zijn in vergelijking met andere kernen19,23. Evenzo tonen hun GPCR-inhoud en signaleringsmachines diversiteit op basis van neuroanatomische locatie en neuronaal type2,24,25,26,27,28,29. Deze eenvoudige waarnemingen tonen aan dat de lengte en samenstelling van zoogdier-cilia’s strak gereguleerd zijn, net als bij modelorganismen, zoals Chlamydomonas reinhardtii, maar de impact van deze lengteverschillen op de functie, signalering en uiteindelijk gedrag van trilharen blijft onduidelijk16,30,31,32.
Het nauwkeurig meten van de lengte en samenstelling van trilharen blijkt een technische uitdaging te zijn die gevoelig is voor gebruikersfouten en onherleidbaarheid. Momenteel worden trilharen in vivo en in vitro meestal geïdentificeerd met behulp van immunofluorescente benaderingen die ciliaire eiwitten of met trilharen verrijkte fluorescerende reporter-allelenlabelen 33,34,35. De lengtes van deze fluorescerend getagde trilharen worden vervolgens gemeten vanaf een 2-dimensionaal (2D) beeld met behulp van lijnmeetinstrumenten in beeldanalyseprogramma’s zoals ImageJ36. Dit proces is niet alleen vervelend en arbeidsintensief, maar ook vatbaar voor vooringenomenheid en fouten. Dezelfde obstakels doen zich voor bij het meten van trilharenintensiteiten, die helpen bij het aangeven van veranderingen in de trilharenstructuur37. Om de inconsistenties in dit soort beeldanalyses te minimaliseren, worden kunstmatige intelligentie (Ai) -programma’s steeds vaker voorkomende en betaalbare opties38.
Ai is de vooruitgang van computersystemen die het voordeel van computeralgoritmen en programmering gebruiken om taken uit te voeren die normaal gesproken menselijke intelligentie vereisen39. Ai-apparaten worden geleerd om terugkerende patronen, parameters en kenmerken waar te nemen en acties te ondernemen om de kans op het creëren van succesvolle resultaten te maximaliseren. Ai is veelzijdig en kan worden getraind om specifieke objecten of interessante structuren, zoals trilharen, te herkennen en vervolgens worden geprogrammeerd om een verscheidenheid aan analyses op de geïdentificeerde objecten uit te voeren. Daarom kunnen complexe beeldgegevens snel en reproduceerbaar worden gegenereerd door Ai38. Automatisering en Ai-analyse van vastgelegde beelden zullen de effectiviteit en efficiëntie verhogen en tegelijkertijd mogelijke menselijke fouten en vooringenomenheid beperken39. Het opzetten van een op Ai gebaseerde methodologie voor de identificatie van trilharen creëert een consistente manier voor alle onderzoeksgroepen om trilharengegevens te analyseren en te interpreteren.
Hier gebruiken we een Ai-module om trilharen zowel in vivo als in vitro op 2D-beelden te identificeren. Met behulp van een set voorbeeldbeelden wordt de Ai getraind om trilharen te identificeren. Zodra de training is voltooid, wordt de aangewezen Ai gebruikt om een binair masker toe te passen op Ai-geïdentificeerde trilharen in een afbeelding. De door de Ai aangebrachte binaries zijn indien nodig aanpasbaar om ervoor te zorgen dat alle trilharen in de afbeeldingen correct worden geïdentificeerd en niet-specifieke identificatie wordt geëlimineerd. Na het gebruik van de Ai om trilharen te identificeren, worden op maat gemaakte algemene analyseprogramma’s (GA) gebruikt om verschillende analyses uit te voeren, zoals het meten van de lengte van de trilharen en de fluorescentie-intensiteit. De verzamelde gegevens worden geëxporteerd naar een tabel die gemakkelijk kan worden gelezen, geïnterpreteerd en gebruikt voor statistische analyses(figuur 1). Het gebruik van geautomatiseerde technologie en Ai om trilharen te identificeren en specifieke metingen tussen experimentele groepen te verkrijgen, zal helpen bij toekomstige studies die gericht zijn op het begrijpen van de impact van de Cilia-functie en morfologie van het CZS op cel-celcommunicatie en -gedrag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lengte- en intensiteitsmetingen zijn gebruikelijke manieren waarop primaire trilharen worden geanalyseerd, maar er is geen gestandaardiseerde conventionele methode die in het veld wordt gebruikt. Identificatie en kwantificering van primaire trilharen met behulp van software zoals ImageJ is tijdrovend en gevoelig voor gebruikersbias en fouten. Dit maakt het moeilijk om grote datasets nauwkeurig te analyseren. Hier laten we zien dat het gebruik van een Ai-programma veel van deze uitdagingen kan overwinnen, waardoor een hoge doorvoeranalyse van primaire trilharen haalbaar is. Hierin beschrijven we de procedure voor het trainen van een Ai-gebaseerde applicatie om primaire trilharen te herkennen en schetsen we de stappen die nodig zijn om lengte en intensiteit te analyseren.
Hoewel de initiële training van de Ai om trilharen te herkennen veel tijd van de gebruiker vereist, kan deze, eenmaal voltooid, worden gebruikt op elke dataset die met dezelfde parameters is verkregen. Het binaire masker dat door de Ai wordt gegenereerd, kan zodanig worden gewijzigd dat eventuele fouten kunnen worden gecorrigeerd. Fouten in de identificatie van trilharen moeten de gebruiker echter het signaal geven dat de Ai verder moet worden getraind met extra beelden. Een groot voordeel van deze methode is dat de Ai getraind kan worden om trilhaartjes in verschillende monstertypen te herkennen in zowel 2D als 3D. Eerdere analysemethoden die in laboratoria zijn gegenereerd, hebben verschillende beperkingen, waaronder het vereisen van handmatige drempels voor identificatie en problemen met het identificeren van trilharen die zijn afgebeeld uit weefselsecties waar de celdichtheid hoog is36,46,47. Deze methoden zijn ook gespecialiseerd voor trilharenanalyse, terwijl analyse met behulp van NIS Elements-software verschillende aspecten van de beelden tegelijkertijd kan evalueren. Omdat de hier beschreven Ai deel uitmaakt van het NIS Elements-softwarepakket, kunnen beelden die met een Nikon-microscoop zijn verkregen, eenvoudig worden voortgezet tot analyse. Beeldvorming met Nikon is echter niet vereist voor het gebruik van deze methode. Ongeacht het vastgelegde raw data-bestandsformaat, kunnen “.tif” -bestanden door NIS Elements worden geopend om te gebruiken in de Ai.
Deze Ai-toepassing binnen NIS Elements is breed beschikbaar en mogelijk al onderdeel van beeldanalysesoftware die wordt gebruikt door laboratoria die primaire trilharen bestuderen. Nu de prevalentie van Ai-technologie toeneemt, kunnen andere beeldvormingssoftware hun analyseopties uitbreiden met een vergelijkbare Ai-module. Het toepassen van Ai-analyse op trilharenidentificatie kan worden gebruikt voor verschillende aspecten van trilharenanalyse. Hoewel we methoden hebben geschetst voor een paar eenvoudige analyses zoals lengte(figuur 2 en 3),intensiteit(figuur 4)en colocalisatie(figuur 5),kan meer geavanceerde analyse worden toegevoegd aan de GA3-analyseworkflow zoals in figuur 6. In plaats van bijvoorbeeld de intensiteit van een volledig cilium te meten, kunnen verschillen in intensiteit binnen een subregio van een cilium van belang zijn om subciliaire lokalisatie te beoordelen. Verschillen in intensiteit binnen een subregio van een cilium kunnen erop wijzen dat het eiwit zich ophoopt aan de punt of de basis van het cilium, zoals hoe Gli-eiwitten worden verrijkt aan de punt van trilharen48. Bovendien kan deze Ai-toepassing worden gebruikt om gemakkelijk verschillen tussen genotypen of behandelingsgroepen te identificeren. Hoewel ons laboratorium deze methode voornamelijk gebruikt om trilharen uit hersensecties of neuronale culturen te analyseren, kan deze worden toegepast op afbeeldingen die zijn verkregen uit verschillende cellijnen of andere weefseltypen. De flexibiliteit van het monstertype waarop deze toepassing kan worden gebruikt, maakt deze analysemethode waardevol voor veel verschillende groepen die primaire trilharen of afzonderlijke organellen bestuderen die worden beoordeeld, zoals mitochondriën, kern of ER.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 aan NFB en de American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 aan RB. We bedanken Rich Gruskin General Manager van Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft en Teresa Mastracci voor inzichtelijke opmerkingen over het manuscript.
Materials
| Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM | Intel Corporation | W-2123 | Processor used for running NIS Elements. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments Inc. | – | Ai and GA3 software |
| Quadro RTX 4000 Graphics card | NVIDIA Corporation | Quadro RTX 4000 | |
| Windows 10 Professional 64-bit | Microsoft Inc. | – | Operating system used for running NIS Elements |
| Workstation | HP Development Company, L.P. | HP Z4G4 | Workstation used for running NIS Elements |
References
- Wang, L., et al. Ciliary gene RPGRIP1L is required for hypothalamic arcuate neuron development. JCI Insight. 4 (3), (2019).
- Siljee, J. E., et al. Subcellular localization of MC4R with ADCY3 at neuronal primary cilia underlies a common pathway for genetic predisposition to obesity. Nature Genetics. 50 (2), 180-185 (2018).
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Current Biology. 17 (18), 1586-1594 (2007).
- Berbari, N. F., O’Connor, A. K., Haycraft, C. J., Yoder, B. K. The primary cilium as a complex signaling center. Current Biology. 19 (13), 526-535 (2009).
- Walz, G. Role of primary cilia in non-dividing and post-mitotic cells. Cell Tissue Research. 369 (1), 11-25 (2017).
- Nachury, M. V., Mick, D. U. Establishing and regulating the composition of cilia for signal transduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (7), 389-405 (2019).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Engle, S. E., Bansal, R., Antonellis, P. J., Berbari, N. F. Cilia signaling and obesity. Seminars in Cell and Developmental Biology. , (2020).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatric Nephrology. 26 (7), 1039-1056 (2011).
- Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. New England Journal of Medicine. 364 (16), 1533-1543 (2011).
- Vaisse, C., Reiter, J. F., Berbari, N. F. Cilia and Obesity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), (2017).
- Berbari, N. F., et al. Leptin resistance is a secondary consequence of the obesity in ciliopathy mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), 7796-7801 (2013).
- Jacobs, D. T., et al. Dysfunction of intraflagellar transport-A causes hyperphagia-induced obesity and metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 789-798 (2016).
- Arsov, T., et al. Fat aussie–a new Alström syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis. Molecular Endocrinology. 20 (7), 1610-1622 (2006).
- Tam, L. W., Ranum, P. T., Lefebvre, P. A. CDKL5 regulates flagellar length and localizes to the base of the flagella in Chlamydomonas. Molecular Biology of the Cell. 24 (5), 588-600 (2013).
- Rajagopalan, V., Subramanian, A., Wilkes, D. E., Pennock, D. G., Asai, D. J. Dynein-2 affects the regulation of ciliary length but is not required for ciliogenesis in Tetrahymena thermophila. Molecular Biology of the Cell. 20 (2), 708-720 (2009).
- Bengs, F., Scholz, A., Kuhn, D., Wiese, M. LmxMPK9, a mitogen-activated protein kinase homologue affects flagellar length in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology. 55 (5), 1606-1615 (2005).
- Han, Y. M., et al. Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2193-2197 (2014).
- Caspary, T., Marazziti, D., Berbari, N. F., Satir, P., Tvorup Christensen, S. . Cilia: Methods and Protocols. , 203-214 (2016).
- Bishop, G. A., Berbari, N. F., Lewis, J., Mykytyn, K. Type III adenylyl cyclase localizes to primary cilia throughout the adult mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 505 (5), 562-571 (2007).
- Domire, J. S., Mykytyn, K. Markers for neuronal cilia. Methods in Cell Biology. 91, 111-121 (2009).
- Sun, J. S., et al. Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), (2021).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Research. 872 (1-2), 271-275 (2000).
- Domire, J. S., et al. Dopamine receptor 1 localizes to neuronal cilia in a dynamic process that requires the Bardet-Biedl syndrome proteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (17), 2951-2960 (2011).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89 (3), 909-926 (1999).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), 10335-10340 (2014).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
- Berman, S. A., Wilson, N. F., Haas, N. A., Lefebvre, P. A. A novel MAP kinase regulates flagellar length in Chlamydomonas. Current Biology. 13 (13), 1145-1149 (2003).
- Nguyen, R. L., Tam, L. W., Lefebvre, P. A. The LF1 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a novel protein required for flagellar length control. Genetics. 169 (3), 1415-1424 (2005).
- Tam, L. W., Wilson, N. F., Lefebvre, P. A. A CDK-related kinase regulates the length and assembly of flagella in Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 176 (6), 819-829 (2007).
- O’Connor, A. K., et al. An inducible CiliaGFP mouse model for in vivo visualization and analysis of cilia in live tissue. Cilia. 2 (1), 8 (2013).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
- Delling, M., et al. Primary cilia are not calcium-responsive mechanosensors. Nature. 531 (7596), 656-660 (2016).
- Saggese, T., Young, A. A., Huang, C., Braeckmans, K., McGlashan, S. R. Development of a method for the measurement of primary cilia length in 3D. Cilia. 1 (1), 11 (2012).
- Kobayashi, Y., Hamamoto, A., Saito, Y. Analysis of ciliary status via G-protein-coupled receptors localized on primary cilia. Microscopy. 69 (5), 277-285 (2020).
- Zhou, L. Q., et al. Artificial intelligence in medical imaging of the liver. World Journal of Gastroenterology. 25 (6), 672-682 (2019).
- Naugler, C., Church, D. L. Automation and artificial intelligence in the clinical laboratory. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 56 (2), 98-110 (2019).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Bansal, R., et al. Hedgehog Pathway Activation Alters Ciliary Signaling in Primary Hypothalamic Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 266 (2019).
- Jin, H., et al. The conserved Bardet-Biedl syndrome proteins assemble a coat that traffics membrane proteins to cilia. Cell. 141 (7), 1208-1219 (2010).
- Liew, G. M., et al. The intraflagellar transport protein IFT27 promotes BBSome exit from cilia through the GTPase ARL6/BBS3. Developmental Cell. 31 (3), 265-278 (2014).
- Engle, S. E., et al. A CreER Mouse to Study Melanin Concentrating Hormone Signaling in the Developing Brain. Genesis. , (2018).
- Thorpe, S. D., et al. Reduced primary cilia length and altered Arl13b expression are associated with deregulated chondrocyte Hedgehog signaling in alkaptonuria. Journal of Cellular Physiology. 232 (9), 2407-2417 (2017).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8, 1 (2019).
- Dummer, A., Poelma, C., DeRuiter, M. C., Goumans, M. J., Hierck, B. P. Measuring the primary cilium length: improved method for unbiased high-throughput analysis. Cilia. 5, 7 (2016).
- Haycraft, C. J., et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genetics. 1 (4), 53 (2005).
