Approcci di intelligenza artificiale per valutare le ciglia primarie

Addestrare Ai per identificare le cigliaMisurare e valutare la lunghezza strutturale e la composizione delle ciglia può essere un processo noioso, dispendioso in termini di tempo e soggetto a errori. Qui, usiamo Ai per segmentare accuratamente le ciglia da un ampio pool di immagini e analizzarne lunghezze e intensità con uno strumento di analisi (Figura 1). Tutti gli approcci ai richiedono passaggi di formazione per la loro implementazione. Abbiamo stabilito una pipeline di formazione per riconoscere le ciglia, che è stata eseguita applicando manualmente maschere binarie su strutture ciliari. Queste informazioni vengono quindi utilizzate per addestrare l’IA in base alle caratteristiche dei pixel sotto i binari applicati. Come linea guida generale, la formazione coinvolge il software che passa attraverso diverse iterazioni, circa 1000, ed è considerata ottimale se il tasso di perdita o di errore dell’allenamento è inferiore all’1%. Tuttavia, il numero di iterazioni ed errori nel processo di training può variare a seconda delle immagini di esempio utilizzate per il training. Ad esempio, dopo le nostre sessioni di allenamento utilizzando immagini di ciglia neuronali in vitro, il tasso di errore è stato dell’1,378% rispetto al 3,36% per le immagini della sezione cerebrale in vivo (Figura supplementare 1). Una volta completato l’addestramento, l’Ai può quindi essere utilizzato per segmentare le ciglia dalle immagini sperimentali in pochi secondi e le maschere binarie risultanti vengono utilizzate per misurare i parametri strutturali. Ciò elimina la necessità di segmentare gli oggetti utilizzando il metodo tradizionale di soglia di intensità che può essere difficile nelle immagini con elevato rumore di fondo o quando gli oggetti sono in prossimità l’uno dell’altro. Ai riduce anche il potenziale di errore e distorsione applicando lo stesso algoritmo a tutte le immagini, indipendentemente dall’utente. Misurazione della lunghezza delle ciglia utilizzando GA3La lunghezza delle ciglia è strettamente regolata ed è associata a impatti funzionali sulla segnalazione ciliare16,19. Qui, abbiamo misurato le lunghezze delle ciglia utilizzando una pipeline di analisi all’interno del software NIS Elements chiamata General Analysis 3 o GA3. GA3 aiuta a combinare più strumenti in un unico flusso di lavoro per creare routine personalizzate per ogni esperimento. Abbiamo iniziato misurando le lunghezze delle ciglia in una linea cellulare. Le cellule cilia su midollo interno del dotto di raccolta del topo (IMCD-3) sono state immunoamarcate con tubulina acetilata e fotografate usando un microscopio confocale. Abbiamo misurato le lunghezze delle ciglia usando GA3 dopo la segmentazione con segment.ai (Figura supplementare 3A). Mentre la α-tubulina acetilata si trova preferenzialmente nel cilio primario, si trova anche in altre regioni ricche di microtubuli come il citoscheletro e il ponte citocinetico. L’Ai addestrato ha identificato correttamente le ciglia nell’immagine ma non altre strutture positive di tubulina acetilate non ciliari. Le ciglia sulle cellule IMCD variavano da 0,5 μm a 4,5 μm con una lunghezza media di 1,8 ± 0,04 μm (Figura 2A). Successivamente abbiamo testato la capacità dell’Ai di misurare le lunghezze delle ciglia nelle colture neuronali primarie. Abbiamo coltivato neuroni dall’ipotalamo e dall’ippocampo di topi neonatali per 10 giorni e li abbiamo immunomarcati con il marcatore delle ciglia adenilato ciclasi III (ACIII)21,41. Quando si analizzano le colture neuronali, abbiamo trovato utile applicare un filtro prima di analizzare statisticamente le lunghezze. A causa di un rapporto segnale/rumore inferiore, sono stati identificati diversi oggetti inferiori a 1 μm che non erano ciglia. Pertanto, abbiamo filtrato i dati per eliminare tutti gli oggetti che erano meno di 1 μm di lunghezza per garantire che solo le ciglia fossero analizzate. Nei neuroni ipotalamici in coltura, le lunghezze delle ciglia variavano da 2 μm a 7 μm con una lunghezza media di 3,8 ± 0,19 μm (Figura 2B). È interessante notare che le ciglia neuronali ippocampali coltivate erano più lunghe con una lunghezza media di 6,73 ± 0,15 μm (Figura 2C). È stato riportato che diversi nuclei neuronali all’interno dell’ipotalamo mostrano lunghezze di ciglia distinte e che queste ciglia alterano le loro lunghezze in risposta a cambiamenti fisiologici in un modo specifico del nucleo19,23. Pertanto, abbiamo anche etichettato sezioni cerebrali ipotalamiche da topi maschi adulti C57BL / 6J con ACIII e abbiamo ripreso il nucleo arcuato (ARC) e il nucleo paraventricolare (PVN). Usando GA3 per misurare le lunghezze delle ciglia, abbiamo osservato che le ciglia ipotalamiche in vivo apparivano più lunghe delle ciglia in vitro. Nello specifico, le ciglia ipotalamiche in vivo vanno da 1 μm a circa 15 μm (Figura 3). Non ci sono state differenze significative tra le lunghezze delle ciglia nel PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) e quelle nell’ARC (6,16 ± 0,27 μm) (Figura 3C)23. Allo stesso modo, le ciglia nella regione del cornu ammonis (CA1) dell’ippocampo mostrano un intervallo di lunghezza più stretto da 1 μm a 10 μm con una lunghezza media di 5,28 ± 0,33 μm (Figura 3). In conformità con studi pubblicati in precedenza, la nostra analisi utilizzando strumenti Ai e GA3 ha mostrato che le ciglia di diverse regioni del cervello mostrano diversità in lunghezza19,23. Inoltre, utilizzando questo approccio Ai siamo in grado di valutare rapidamente un gran numero di ciglia. Misurazione della composizione delle ciglia utilizzando GA3Il cilio primario è un hub di segnalazione per molte vie che utilizzano diversi tipi di proteine per svolgere funzioni uniche come proteine motorie, proteine di trasporto intraflagellare e GPCR per citarne alcuni3,24,42,43. Mantenere i livelli appropriati di queste proteine all’interno del cilio è importante per il corretto funzionamento e spesso appare dipendente dal contesto cellulare. L’etichettatura fluorescente di queste proteine non solo ci ha permesso di visualizzarle, ma anche di quantificare le loro intensità come misura della quantità di proteina marcata all’interno del compartimento relativamente piccolo20. Pertanto, abbiamo cercato di determinare le intensità di un GPCR ciliare, Melanin Concentrating Hormone Receptor 1 (MCHR1), in vivo sia nell’ARC che nel PVN dell’ipotalamo di topi maschi adulti24,44. Usando Ai e GA3, abbiamo misurato le lunghezze delle ciglia positive MCHR1 insieme alle intensità per garantire che gli oggetti contati fossero ciglia (Figura supplementare 3A). Abbiamo eliminato gli oggetti post-analisi che erano meno di 2 μm di lunghezza e analizzato le intensità delle maschere binarie rimanenti. È interessante notare che abbiamo scoperto che l’intensità di MCHR1 ciliare in PVN è significativamente superiore a quella in ARC che indica una presenza più forte di MCHR1 ciliare in PVN (Figura 4). Sono necessari ulteriori studi per determinare il significato di MCHR1 ciliare in questi circuiti neuronali. Abbiamo anche misurato le intensità di MCHR1 ciliare nei neuroni primari in coltura di ipotalamo e ippocampo. Le ciglia di entrambe le colture mostrano un’ampia distribuzione delle intensità di MCHR1 suggerendo la presenza di popolazioni neuronali eterogenee (Figura supplementare 2). Pertanto, l’utilizzo di sofisticati strumenti analitici come Ai e GA3 consente la valutazione dell’eterogeneità delle ciglia all’interno dello stesso tessuto o tra più tessuti. Sarà interessante vedere se altri GPCR neuronali mostrano differenze simili nella loro localizzazione all’interno dei neuroni dello stesso tessuto e se questo si altera in risposta a cambiamenti fisiologici. ColocalizzazioneMentre misurare le intensità di fluorescenza all’interno di un campo di immagine completo può dare un’impressione di proteina, non riesce a fornire informazioni come la distribuzione spaziale o la vicinanza ad altre proteine vicine e strutture cellulari. Qui, abbiamo misurato la sovrapposizione di MCHR1 con ACIII come marcatore di ciglia tracciando le intensità di MCHR1 rispetto a quella di ACIII per ogni maschera binaria (Figura 5). Il grafico mostra che la maggior parte delle ciglia sono positive per entrambi, ACIII e MCHR1, anche se alcune ciglia mostrano un’espressione più forte di un canale rispetto all’altro. Inoltre, ci sono alcune ciglia che mostrano la presenza di ACIII o MCHR1 come è evidente dai punti che si trovano direttamente sull’asse x e sull’asse y rispettivamente. Per quantificare questa sovrapposizione, abbiamo misurato il coefficiente di sovrapposizione di Mander e confrontato l’estensione dell’espressione di MCHR1 nelle ciglia neuronali dell’ARC e PVN40. È interessante notare che la nostra analisi ha rivelato che c’è stato un aumento significativo dei coefficienti del PVN (0,6382 ± 0,0151) rispetto a quelli dell’ARC (0,5430 ± 0,0181) (Figura 5C). Ciò è coerente con i nostri dati precedenti in cui abbiamo osservato intensità MCHR1 più elevate in PVN rispetto ad ARC (Figura 4). Questi dati suggeriscono che, come la lunghezza delle ciglia, il modello di espressione di MCHR1 nel compartimento ciliare varia in diverse regioni del cervello. Utilizzando la stessa pipeline di analisi, sarà possibile determinare se altri GPCR ciliari come il recettore Neuropeptide Y di tipo 2 (NPY2R) e il recettore della somatostatina di tipo 3 (SSTR3) mostrano quantità simili di diversità. Profilo di intensità di misurazione lungo il cilioUna volta che le ciglia sono state identificate utilizzando segment.ai, la ricetta GA3 può essere modificata per combinare l’analisi delle ciglia con l’identificazione di altre strutture di interesse nell’immagine. Ad esempio, l’etichettatura con marcatori del corpo basale è utile per l’identificazione della polarità delle ciglia. Per fare questa analisi, abbiamo ripreso sezioni cerebrali ipotalamiche da topi P0 che esprimono ARL13B-mCherry e Centrin2-GFP e abbiamo ripreso ARC e PVN34. Qui, le ciglia sono state identificate usando Ai come prima, ma ora la ricetta GA3 modificata include l’identificazione di Centrin2-GFP, una proteina centriolare trovata alla base delle ciglia (Figura supplementare 3B). Etichettando Centrin2-GFP, la base delle ciglia può essere distinta dalle punte delle ciglia positive ARL13B-mCherry (Figura 6A). Quindi, invece di misurare l’intensità all’interno di tutte le ciglia, siamo in grado di misurare i cambiamenti nell’intensità ARL13B lungo la lunghezza delle ciglia (Figura 6B). Possiamo anche confrontare le differenze nell’intensità di ARL13B tra le estremità prossimali e le estremità distali delle ciglia. Per fare questo, abbiamo diviso la lunghezza del cilio in contenitori da 1 micron a partire dalla base e designato il primo contenitore micron come estremità prossimale e l’ultimo contenitore micron come estremità distale. La nostra analisi ha rivelato che c’è significativamente più ARL13B presente più vicino alla base rispetto alla punta del cilio sia in ARC che in PVN, e questo è coerente con studi precedentemente pubblicati sui condrociti umani45 (Figura 6C). In questo tipo di analisi, invece di applicare un filtro di lunghezza per escludere piccoli oggetti non ciliari dall’analisi, vengono analizzate solo le ciglia associate all’etichettatura Centrin2-GFP. Ciò può essere vantaggioso in situazioni in cui le mutazioni genetiche rendono le ciglia molto corte o se sono stati implicati cambiamenti nei sottodomini delle ciglia come la zona di transizione o la punta. L’identificazione delle ciglia utilizzando l’analisi Ai e GA3 è altamente adattabile e può essere adattata per adattarsi a una varietà di domande di ricerca complesse. Figura 1. Flusso di lavoro per la misurazione della lunghezza e dell’intensità delle ciglia utilizzando Ai. (A) Per addestrare l’IA, i binari sono disegnati attorno agli oggetti di interesse (ciglia) sulle immagini di allenamento grezze. Utilizzando i binari disegnati, Segment Ai viene addestrato a riconoscere la forma e l’intensità dei pixel delle ciglia. (B) Successivamente, il segmento Ai addestrato viene applicato alle immagini sperimentali grezze. Disegna binari su oggetti che riconosce come ciglia. Questi binari possono essere perfezionati per assicurarsi che tutte e solo le ciglia vengano analizzate. (C) Un programma GA3 è costruito per analizzare l’intensità e la lunghezza degli oggetti riconosciuti dall’Ai. (D) I record vengono importati in una tabella del software. Questa tabella può quindi essere esportata per ulteriori analisi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. Misure in vitro della lunghezza delle ciglia. Immagini rappresentative di ciglia in (A) cellule IMCD (verde, tubulina acetilata) (B) colture ipotalamiche primarie (verde, ACIII) e (C) colture ippocampali (verde, ACIII). Un Ai addestrato è stato usato per riconoscere le ciglia come mostrato nella maschera binaria (magenta) e quindi GA3 è stato usato per misurare la lunghezza delle ciglia. La distribuzione della lunghezza delle ciglia è rappresentata graficamente come percentuale di ciglia in contenitori da 0,5 o 1,0 micron. * indica il ponte citocinetico correttamente non riconosciuto dall’Ai. n=225 ciglia in cellule IMCD da 3 replicate, 54 ciglia in ipotalamo e 139 ciglia in colture ippocampali da 3 animali. Barre di scala 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Misure di lunghezza delle ciglia in vivo. (A) Immagini rappresentative di ciglia (verde, ACIII) nelle sezioni ARC, PVN e CA1 di sezioni cerebrali di topi adulti. (B)Un Ai addestrato in NIS Elements è stato usato per riconoscere le ciglia come mostrato nella maschera binaria (magenta) e quindi GA3 è stato usato per misurare la lunghezza delle ciglia. (C) La distribuzione della lunghezza delle ciglia è rappresentata graficamente come percentuale delle ciglia in contenitori da un micron. n= 68 ciglia in ARC, 36 in PVN e 29 in CA1 da 3 animali. Barre di scala 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4. Ai ha assistito le misurazioni dell’intensità della colorazione delle ciglia neuronali ipotalamiche. (A) Immagini rappresentative di ciglia (MCHR1, rosso) nell’ARC e PVN delle sezioni cerebrali di topo adulto. Un Ai addestrato in NIS Elements è stato utilizzato per riconoscere le ciglia come mostrato nella maschera binaria (ciano) e quindi GA3 è stato utilizzato per misurare l’intensità della colorazione MCHR1 nelle ciglia. (B) Le intensità MCHR1 sono rappresentate come medie ± S.E.M. Ogni punto rappresenta un cilio. * p < 0.05, T-test dello studente. (C) La distribuzione dell’intensità mcHR1 è rappresentata graficamente come percentuale di ciglia in contenitori di 0,2 x10 7 unità arbitrarie (U. A.). n= 53 ciglia in ARC, 78 in PVN da 3 animali. Barre di scala 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5. Ai ha assistito l’analisi della colocalizzazione delle ciglia. (A, B) Immagini rappresentative delle ciglia nell’ARC e nel PVN rispettivamente. Le ciglia sono etichettate con ACIII (verde) e MCHR1 (rosso). Un Ai addestrato in NIS Elements è stato utilizzato per riconoscere le ciglia come mostrato nella maschera binaria (magenta per le ciglia etichettate ACIII, ciano per le ciglia marcate MCHR1). GA3 è stato utilizzato per riconoscere le ciglia che contenevano sia ACIII che MCHR1. (C) I valori del coefficiente di sovrapposizione di Manders (MOC) sono rappresentati graficamente come ± S.E.M. Ogni punto rappresenta un cilio. * p < 0.05, T-test dello studente. (D) Grafico a dispersione dell’intensità MCHR1 rispetto all’intensità ACIII in ARC e PVN. Ogni punto rappresenta un cilio. n= 72 ciglia in ARC, 47 in PVN da 3 animali. Barre di scala 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6. Analisi delle ciglia e del corpo basale. (A) Immagini rappresentative di ciglia (rosso, ARL13B-mCherry) e marcatore del corpo basale (verde, Centrin2-GFP) nell’ARC e PVN dei topi P0. Un Ai addestrato è stato usato per riconoscere le ciglia come mostrato nella maschera binaria (ciano). La maschera binaria per il corpo basale (magenta) è stata disegnata mediante soglia nella ricetta GA3. (B) Intensità di scansione di linea rappresentativa di un cilio. (C) Le intensità di ARL13B alle estremità prossimale e distale di Ai hanno identificato le ciglia rappresentate come medie ± S.E.M. Le estremità prossimale e distale sono definite come la regione all’interno della prima lunghezza di 1 μm e dell’ultima lunghezza di 1 μm rispettivamente dalla base del cilio. Ogni punto rappresenta un cilio. * p < 0,05. n = 6 ciglia in ARC da 2 animali e 21 ciglia in PVN da 3 animali. Barre di scala 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 1. Grafici di perdita di allenamento Ai. (A, B) Grafici che mostrano la perdita di segment.ai di allenamento sulle ciglia neuronali rispettivamente in vitro e in vivo. Fare clic qui per scaricare questo file. Figura supplementare 2. Ai Assisted Cilia misure di intensità di colorazione delle ciglia neuronali in vitro. (A, B) Immagini rappresentative di ciglia (MCHR1, rosso) rispettivamente nelle colture ipotalamiche primarie e ippocampali. Un Ai addestrato in NIS Elements è stato utilizzato per riconoscere le ciglia come mostrato nella maschera binaria (ciano) e quindi GA3 è stato utilizzato per misurare l’intensità della colorazione MCHR1 nelle ciglia. La distribuzione dell’intensità di MCHR1 è rappresentata graficamente come percentuale di ciglia in 1000 contenitori U.A. per ipotalamo e 2000 A. U. per colture ippocampali. n= 30 ciglia in ipotalamo e 106 ciglia in colture ippocampali di 3 animali. Barre di scala 10 μm. Fare clic qui per scaricare questo file. Figura supplementare 3. Analisi generale 3 ricette per l’analisi delle ciglia. (A) Ricetta di analisi generale semplice (GA3) per la misurazione della lunghezza delle ciglia, dell’intensità e del coefficiente di Mander. (B) Ricetta GA3 complessa per la misurazione dell’intensità lungo la lunghezza del cilio utilizzando un marcatore per il corpo basale. Fare clic qui per scaricare questo file.