גישות בינה מלאכותית להערכת ריסים ראשוניים
Summary
השימוש בבינה מלאכותית (Ai) לניתוח תמונות מתגלה כגישה חזקה, פחות מוטה ומהירה בהשוואה לשיטות נפוצות. כאן אימנו את Ai לזהות אברון תאי, ריסים ראשוניים, ולנתח תכונות כגון אורך ועוצמת הכתמים באופן קפדני ושחזורי.
Abstract
Cilia הם נספחים תאיים מבוססי מיקרוטובול המתפקדים כמרכזי איתות למגוון מסלולי איתות בסוגי תאי יונקים רבים. אורך Cilia נשמר מאוד, מוסדר היטב, ומשתנה בין סוגי תאים ורקמות שונים והיה מעורב בהשפעה ישירה על יכולת האיתות שלהם. לדוגמה, הוכח כי cilia משנה את אורךם בתגובה להפעלת קולטנים מצמידי חלבון G. עם זאת, מדידה מדויקת ורבייה של ריסים רבים היא הליך גוזל זמן רב ועבודה אינטנסיבית. גישות נוכחיות הן גם שגיאה והטיה נוטה. ניתן להשתמש בתוכניות בינה מלאכותית (Ai) כדי להתגבר על אתגרים רבים אלה בשל יכולות המאפשרות התבוללות, מניפולציה ואופטימיזציה של ערכות נתונים נרחבות. כאן, אנו מדגימים כי מודול Ai ניתן לאמן לזהות cilia בתמונות הן בדגימות vivo והן במבחנה. לאחר שימוש ב- Ai מאומן לזיהוי ריסים, אנו מסוגלים לעצב ולנצל במהירות יישומים המנתחים מאות ריסים במדגם יחיד לאורך, עוצמת פלואורסצנטיות ולוקליזציה משותפת. גישה בלתי משוחדת זו הגבירה את הביטחון והקפדנות שלנו כאשר משווים דגימות מהקדמה עצבית ראשונית שונה במבחנה, כמו גם על פני אזורי מוח שונים בתוך בעל חיים ובין בעלי חיים. יתר על כן, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לנתח באופן אמין את הדינמיקה cilia מכל סוג תא ורקמות באופן תפוקה גבוהה על פני דגימות מרובות וקבוצות טיפול. בסופו של דבר, גישות מבוססות Ai צפויות להפוך לסטנדרט ככל שרוב השדות נעים לעבר גישות פחות מוטות ויותר ניתנות לשחזור לרכישת וניתוח תמונות.
Introduction
ריסים עיקריים הם אברונים חושיים הבולטים מרוב סוגי תאי היונקים1,2,3,4. הם בדרך כלל נספחים בודדים קריטי לתיאום מסלולי איתות תאים מגוונים על ידי שילוב אותות חוץ תאיים5,6,7. ריסים ראשוניים ממלאים תפקידים חשובים במהלך התפתחות עוברית והומאוסטזיס של רקמות בוגרות, ושיבוש תפקודם או המורפולוגיה שלהם קשור למספר הפרעות גנטיות, הנקראות יחד ciliopathies. בשל האופי הכמעט בכל מקום של ריסים, ciliopathies קשורים עם מגוון רחב של תכונות קליניות שיכולות להשפיע על כל מערכות האיברים8,9,10,11,12. במודלים בעלי חיים של ciliopathies, אובדן מבנה ciliary או יכולת איתות מתבטא במספר פנוטיפים רלוונטיים קלינית כולל השמנת יתר הקשורים היפרפגיה3,13,14,15. במערכות מודל רבות, שינויים באורך ריסים הוכחו להשפיע על יכולת האיתות שלהםפונקציות 16,17,18,19. עם זאת, ישנם מספר אתגרים ארוכי זמן וטכניים הקשורים להערכה מדויקת ורבייה של אורך הריסים והרכב.
מערכת העצבים המרכזית של היונקים הבוגרים (CNS) היא הקשר ביולוגי אחד שהציב אתגר להבנת מורפולוגיה ותפקוד ריסים. אמנם נראה כי נוירונים ותאים ברחבי מערכת רה”מ מחזיקים ריסים, בשל הכלים המוגבלים והיכולות להתבונן ולנתח את הריסים האלה הבנה של הפונקציות שלהם נשאר חמקמק20. לדוגמה, סמן הריסים הרב-טיפוס, אצטילאט α-טובולין, אינו מתייג ריסים עצביים20. הקושי לחקור את הריסים האלה נפתר בחלקו עם גילוי של מספר קולטנים מצמידי חלבון G (GPCR), מכונות איתות וחלבונים הקשורים לממברנה המועשרים על הממברנה של ריסים עצביים21,22. כל התצפיות הבסיסיות הפשוטות הללו מרמזות על החשיבות והמגוון של ריסים של CNS, אשר עד כה נראה שאין שני לו על ידי רקמות אחרות. לדוגמה, וריאציה באורך סיליה ולוקליזציה GPCR ניתן לראות בכל המוח, עם אורכים בגרעין עצבי מסוים להיות שונה בהשוואה גרעין אחרים19,23. באופן דומה, התוכן GPCR שלהם מחמאה מכונות איתות להראות גיוון המבוסס על מיקום נוירואנטומי וסוג עצבי2,24,25,26,27,28,29. תצפיות פשוטות אלה ממחישות כי אורך הריסים של היונקים והרכבם מוסדרים היטב, בדיוק כמו באורגניזמים מודל, כמו Chlamydomonas reinhardtii, אבל ההשפעה של הבדלי אורך אלה על תפקוד cilia, איתות ובסופו של דבר התנהגות עדיין לא ברור16,30,31,32.
מדידה מדויקת של אורך הריסים והרכבה מתגלה כאתגר טכני שנוטה לשגיאת משתמש וחוסר תוכחות. כיום cilia ב vivo ו במבחנה מזוהים לרוב באמצעות גישות אימונופלואורסצנטיות המגדירות חלבונים סיליאריים או כתב פלואורסצנטי מועשר ריסים אללס33,34,35. האורכים של ריסים מתויגים פלואורסצנטיים אלה נמדדים לאחר מכן מתמונה דו-ממדית (דו-ממדית) באמצעות כלי מדידת קו בתוכניות ניתוח תמונה כגון ImageJ36. תהליך זה הוא לא רק מייגע ועבודה אינטנסיבית, אלא גם נוטה הטיה וטעייה. אותם מכשולים מתעוררים בעת מדידת עוצמות ריסים, המסייעים להצביע על שינויים במבנהריסים 37. כדי למזער את חוסר העקביות בסוגים אלה של ניתוחי תמונה, תוכניות בינה מלאכותית (Ai) הופכות נפוץ יותר ובמחיר סביר אפשרויות38.
Ai הוא קידום של מערכות מחשב המשתמשות ביתרון של אלגוריתמים ממוחשבים ותכנות לביצוע משימות שבדרך כלל דורשות אינטליגנציה אנושית39. מכשירי Ai לומדים לתפוס דפוסים, פרמטרים ומאפיינים חוזרים ולנקוט פעולות כדי למקסם את הסיכויים ליצירת תוצאות מוצלחות. Ai הוא רב-תכליתי וניתן לאמן אותו לזהות אובייקטים או מבנים ספציפיים בעלי עניין, כגון cilia, ולאחר מכן להיות מתוכנת להפעיל מגוון של ניתוחים על האובייקטים המזוהים. לכן, נתוני תמונה מורכבים יכולים להיווצר במהירות ובשחזור על ידי Ai38. אוטומציה וניתוח Ai של תמונות שנתפסו יגבירו את היעילות והיעילות תוך הגבלת כל טעות אנוש פוטנציאלית והטיה39. יצירת מתודולוגיה מבוססת Ai לזיהוי ריסים יוצרת דרך עקבית עבור כל קבוצות המחקר לנתח ולפרש נתוני ריסים.
כאן אנו משתמשים במודול Ai כדי לזהות את הריסים הן ב- vivo והן במבחנה בתמונות 2D. באמצעות קבוצה של תמונות לדוגמה, ה- Ai מאומן לזהות ריסים. לאחר השלמת האימון, Ai המיועד משמש להחלת מסיכה בינארית על ריסים המזוהים על Ai בתמונה. הקבצים הבינאריים המוחלים על ידי Ai ניתנים לשינוי, במידת הצורך, כדי להבטיח שכל הריסים בתמונות מזוהים כראוי וזיהוי לא ספציפי מסולק. לאחר ניצול Ai כדי לזהות cilia, תוכניות ניתוח כללי שנבנה בהתאמה אישית (GA) משמשים לביצוע ניתוחים שונים כגון מדידת אורך cilia ועוצמת פלואורסצנטיות. הנתונים הנאספים מיוצאים לטבלה שניתן לקרוא, לפרש ולהשתמש בה בקלות עבור ניתוחים סטטיסטיים (איור 1). השימוש בטכנולוגיה אוטומטית ובבינה מלאכותית לזיהוי ריסים וקבלת מדידות ספציפיות בין קבוצות ניסוי יסייע במחקרים עתידיים שמטרתם להבין את ההשפעה של תפקוד ריסים של מערכת הסביבה ומורפולוגיה על תקשורת והתנהגות תאים-תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מדידות אורך ועוצמה הן דרכים נפוצות שבהן מנתחים ריסים ראשוניים, עם זאת, אין שיטה קונבנציונלית סטנדרטית המשמשת בתחום. זיהוי וכימות של ריסים ראשיים באמצעות תוכנה כגון ImageJ הוא זמן רב נוטה הטיית משתמש וטעייה. הדבר מקשה על ניתוח מדויק של ערכות נתונים גדולות. כאן אנו מראים כי באמצעות תוכנית Ai יכול להתגבר על רבים מהאתגרים האלה מה שהופך ניתוח תפוקה גבוהה של cilia ראשוני בר השגה. כאן אנו מתארים את ההליך להכשרת יישום מבוסס Ai לזיהוי ריסים ראשוניים ומתארים את השלבים הנדרשים לניתוח אורך ועוצמת.
בעוד ההכשרה הראשונית של Ai לזהות cilia דורש זמן משמעותי מהמשתמש, לאחר השלמתו ניתן להשתמש בו על כל ערכת נתונים שנרכשה עם אותם פרמטרים. המסיכה הבינארית שנוצרת על-ידי ה- Ai ניתנת לשינוי כך שניתן יהיה לתקן שגיאות כלשהן. עם זאת, שגיאות בזיהוי cilia צריך לאותת למשתמש כי Ai צריך להיות מאומן עוד יותר עם תמונות נוספות. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא כי Ai ניתן לאמן לזהות cilia בסוגי מדגם שונים הן 2D ו 3D. שיטות ניתוח קודמות שנוצרו בתוך מעבדות יש מגבלות שונות כולל דרישת סף ידני לזיהוי ובעיות בזיהוי cilia בתמונה מקטעי רקמות שבו צפיפות התא גבוהה36,46,47. שיטות אלה מתמחות גם בניתוח ריסים ואילו ניתוח באמצעות תוכנת אלמנטים של NIS יכול להעריך מספר היבטים של התמונות בו זמנית. מכיוון שה-Ai המתואר כאן הוא חלק מחבילת התוכנה של NIS Elements, ניתן להמשיך בקלות בתמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ ניקון עד לניתוח. עם זאת, הדמיה עם ניקון אינה נדרשת לשימוש בשיטה זו. ללא קשר לתבנית קובץ הנתונים הגולמיים שנתפסו, קבצי “.tif” יכולים להיפתח על ידי רכיבי NIS לשימוש ב- Ai.
יישום AI זה בתוך אלמנטים NIS זמין באופן נרחב ואולי כבר חלק מתוכנת ניתוח תמונה בשימוש על ידי מעבדות לומדות ריסים ראשוניים. עם ההתרחבות של טכנולוגיית הבינה מלאכותית, תוכנות הדמיה אחרות עשויות להרחיב את אפשרויות הניתוח שלהן כך שיכללו מודול AI דומה. החלת ניתוח Ai לזיהוי cilia יכול לשמש עבור מספר היבטים שונים של ניתוח cilia. בעוד שרטטנו שיטות למספר ניתוחים פשוטים כגוןאורך ( איור 2 ו- 3), עוצמה (איור 4) ואנלקציה (איור 5) ניתן להוסיף ניתוח מתוחכם יותר לזרימת העבודה של ניתוח GA3 כמו באיור 6. לדוגמה, במקום למדוד את עוצמתו שלסיליום שלם, הבדלים בעוצמה בתוך תת-אזור שלסיליום עשויים לעניין להעריך לוקליזציה תת-סיליארית. הבדלים בעוצמה בתוך תת-תחזית שלסיליום יכולים להצביע על כך שהחלבון מצטבר בקצה או בבסיס של הסליום, כגון האופן שבו חלבוני Gli מועשרים בקצה ריס48. בנוסף, יישום Ai זה יכול לשמש כדי לזהות בקלות הבדלים בין גנוטיפים או קבוצות טיפול. בעוד המעבדה שלנו משתמשת בעיקר בשיטה זו כדי לנתח ריסים שמצויים מחלקי מוח או מתרביות עצביות, ניתן להחיל אותה על תמונות שנרכשו מקווי תאים שונים או מסוגי רקמות אחרים. הגמישות של סוג המדגם כי יישום זה יכול לשמש על עושה שיטה זו של ניתוח בעל ערך עבור קבוצות רבות ושונות לומדות ריסים ראשוניים או כל אברון נפרד כי הוא מוערך כגון מיטוכונדריה, גרעין, או ER.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות R01 DK114008 ל- NFB ומענק מלגת איגוד הלב האמריקאי #18PRE34020122 ל- RB. אנו מודים לריץ’ גרוסקין, המנהל הכללי של ניקון תוכנה, מליסה בנטלי, קורטני הייקראפט ותרזה מסלאצ’י על הערות תובנות על כתב היד.
Materials
| Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM | Intel Corporation | W-2123 | Processor used for running NIS Elements. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments Inc. | – | Ai and GA3 software |
| Quadro RTX 4000 Graphics card | NVIDIA Corporation | Quadro RTX 4000 | |
| Windows 10 Professional 64-bit | Microsoft Inc. | – | Operating system used for running NIS Elements |
| Workstation | HP Development Company, L.P. | HP Z4G4 | Workstation used for running NIS Elements |
References
- Wang, L., et al. Ciliary gene RPGRIP1L is required for hypothalamic arcuate neuron development. JCI Insight. 4 (3), (2019).
- Siljee, J. E., et al. Subcellular localization of MC4R with ADCY3 at neuronal primary cilia underlies a common pathway for genetic predisposition to obesity. Nature Genetics. 50 (2), 180-185 (2018).
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Current Biology. 17 (18), 1586-1594 (2007).
- Berbari, N. F., O’Connor, A. K., Haycraft, C. J., Yoder, B. K. The primary cilium as a complex signaling center. Current Biology. 19 (13), 526-535 (2009).
- Walz, G. Role of primary cilia in non-dividing and post-mitotic cells. Cell Tissue Research. 369 (1), 11-25 (2017).
- Nachury, M. V., Mick, D. U. Establishing and regulating the composition of cilia for signal transduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (7), 389-405 (2019).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Engle, S. E., Bansal, R., Antonellis, P. J., Berbari, N. F. Cilia signaling and obesity. Seminars in Cell and Developmental Biology. , (2020).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatric Nephrology. 26 (7), 1039-1056 (2011).
- Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. New England Journal of Medicine. 364 (16), 1533-1543 (2011).
- Vaisse, C., Reiter, J. F., Berbari, N. F. Cilia and Obesity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), (2017).
- Berbari, N. F., et al. Leptin resistance is a secondary consequence of the obesity in ciliopathy mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), 7796-7801 (2013).
- Jacobs, D. T., et al. Dysfunction of intraflagellar transport-A causes hyperphagia-induced obesity and metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 789-798 (2016).
- Arsov, T., et al. Fat aussie–a new Alström syndrome mouse showing a critical role for ALMS1 in obesity, diabetes, and spermatogenesis. Molecular Endocrinology. 20 (7), 1610-1622 (2006).
- Tam, L. W., Ranum, P. T., Lefebvre, P. A. CDKL5 regulates flagellar length and localizes to the base of the flagella in Chlamydomonas. Molecular Biology of the Cell. 24 (5), 588-600 (2013).
- Rajagopalan, V., Subramanian, A., Wilkes, D. E., Pennock, D. G., Asai, D. J. Dynein-2 affects the regulation of ciliary length but is not required for ciliogenesis in Tetrahymena thermophila. Molecular Biology of the Cell. 20 (2), 708-720 (2009).
- Bengs, F., Scholz, A., Kuhn, D., Wiese, M. LmxMPK9, a mitogen-activated protein kinase homologue affects flagellar length in Leishmania mexicana. Molecular Microbiology. 55 (5), 1606-1615 (2005).
- Han, Y. M., et al. Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2193-2197 (2014).
- Caspary, T., Marazziti, D., Berbari, N. F., Satir, P., Tvorup Christensen, S. . Cilia: Methods and Protocols. , 203-214 (2016).
- Bishop, G. A., Berbari, N. F., Lewis, J., Mykytyn, K. Type III adenylyl cyclase localizes to primary cilia throughout the adult mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 505 (5), 562-571 (2007).
- Domire, J. S., Mykytyn, K. Markers for neuronal cilia. Methods in Cell Biology. 91, 111-121 (2009).
- Sun, J. S., et al. Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), (2021).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Research. 872 (1-2), 271-275 (2000).
- Domire, J. S., et al. Dopamine receptor 1 localizes to neuronal cilia in a dynamic process that requires the Bardet-Biedl syndrome proteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (17), 2951-2960 (2011).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89 (3), 909-926 (1999).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), 10335-10340 (2014).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
- Berman, S. A., Wilson, N. F., Haas, N. A., Lefebvre, P. A. A novel MAP kinase regulates flagellar length in Chlamydomonas. Current Biology. 13 (13), 1145-1149 (2003).
- Nguyen, R. L., Tam, L. W., Lefebvre, P. A. The LF1 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a novel protein required for flagellar length control. Genetics. 169 (3), 1415-1424 (2005).
- Tam, L. W., Wilson, N. F., Lefebvre, P. A. A CDK-related kinase regulates the length and assembly of flagella in Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 176 (6), 819-829 (2007).
- O’Connor, A. K., et al. An inducible CiliaGFP mouse model for in vivo visualization and analysis of cilia in live tissue. Cilia. 2 (1), 8 (2013).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
- Delling, M., et al. Primary cilia are not calcium-responsive mechanosensors. Nature. 531 (7596), 656-660 (2016).
- Saggese, T., Young, A. A., Huang, C., Braeckmans, K., McGlashan, S. R. Development of a method for the measurement of primary cilia length in 3D. Cilia. 1 (1), 11 (2012).
- Kobayashi, Y., Hamamoto, A., Saito, Y. Analysis of ciliary status via G-protein-coupled receptors localized on primary cilia. Microscopy. 69 (5), 277-285 (2020).
- Zhou, L. Q., et al. Artificial intelligence in medical imaging of the liver. World Journal of Gastroenterology. 25 (6), 672-682 (2019).
- Naugler, C., Church, D. L. Automation and artificial intelligence in the clinical laboratory. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 56 (2), 98-110 (2019).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Bansal, R., et al. Hedgehog Pathway Activation Alters Ciliary Signaling in Primary Hypothalamic Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 266 (2019).
- Jin, H., et al. The conserved Bardet-Biedl syndrome proteins assemble a coat that traffics membrane proteins to cilia. Cell. 141 (7), 1208-1219 (2010).
- Liew, G. M., et al. The intraflagellar transport protein IFT27 promotes BBSome exit from cilia through the GTPase ARL6/BBS3. Developmental Cell. 31 (3), 265-278 (2014).
- Engle, S. E., et al. A CreER Mouse to Study Melanin Concentrating Hormone Signaling in the Developing Brain. Genesis. , (2018).
- Thorpe, S. D., et al. Reduced primary cilia length and altered Arl13b expression are associated with deregulated chondrocyte Hedgehog signaling in alkaptonuria. Journal of Cellular Physiology. 232 (9), 2407-2417 (2017).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8, 1 (2019).
- Dummer, A., Poelma, C., DeRuiter, M. C., Goumans, M. J., Hierck, B. P. Measuring the primary cilium length: improved method for unbiased high-throughput analysis. Cilia. 5, 7 (2016).
- Haycraft, C. J., et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genetics. 1 (4), 53 (2005).
