一次繊毛の評価に対する人工知能のアプローチ

繊毛を同定するAiのトレーニング繊毛の構造長さと組成を測定および評価することは、面倒で時間がかかり、エラーが発生しやすいプロセスです。ここでは、Aiを使用して、画像の大きなプールから繊毛を正確にセグメント化し、その長さと強度を解析ツールで解析します(図1)。Ai のアプローチには、その実装に必要なトレーニングステップが必要です。毛様体構造にバイナリマスクを手動で適用して行われた繊毛を認識するためのトレーニングパイプラインを確立しました。この情報は、適用されたバイナリの下のピクセル特性に基づいて Ai をトレーニングするために使用されます。一般的なガイドラインとして、トレーニングはソフトウェアが数回の反復(約1000回)を経ることを含み、トレーニング損失またはエラー率が1%未満の場合は最適と見なされます。ただし、トレーニング プロセスの反復回数とエラー数は、トレーニングに使用するサンプル イメージによって異なります。例えば、 インビトロ 神経細胞の繊毛画像を用いたトレーニングセッションの後、イン ビボ 脳部画像の3.36%と比較してエラー率は1.378%であった(補足図1)。トレーニングが完了すると、Aiを使用して数秒以内に実験画像から繊毛をセグメント化し、結果として得られたバイナリマスクを使用して構造パラメータを測定します。これにより、バックグラウンドノイズの高い画像や、オブジェクトが近接している場合に困難な従来の強度しきい値方式を使用してオブジェクトをセグメント化する必要がなくなります。Ai は、ユーザーに関係なく、すべての画像に同じアルゴリズムを適用することで、エラーやバイアスの可能性を低減します。 GA3を使用した繊毛長の測定繊毛の長さは厳しく規制されており、毛様体シグナル伝達に対する機能的な影響に関連しています16,19.ここでは、一般分析3またはGA3と呼ばれるNIS要素ソフトウェア内の分析パイプラインを使用して繊毛の長さを測定しました。GA3 は、複数のツールを 1 つのワークフローに組み合わせて、実験ごとにカスタマイズされたルーチンを構築する際に役立ちます。まず、細胞株中の繊毛の長さを測定しました。マウスの内側髄質収集ダクト(IMCD-3)細胞上の繊毛を、アセチル化チューブリンで免疫標識し、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。segment.ai とのセグメント化後にGA3を使用して繊毛の長さを測定しました (補助図3A)。アセチル化されたαチューブリンは、主なシリウムに優先的に見られるが、細胞骨格およびサイトキネティック橋のような他の微小管豊かな領域にも見られる。訓練を受けたAiは、画像内の繊毛を適切に同定したが、他の非毛細動、アセチル化チューブリン陽性構造は同定しなかった。IMCD細胞の繊毛は、0.5 μmから4.5μmの範囲で、平均長さは1.8±0.04 μm(図2A)でした。次に、Aiが主要な神経細胞培養における繊毛の長さを測定する能力をテストしました。新生児マウスの視床下部および海馬から10日間培養し、繊毛マーカーアデニルシクラーゼIII(ACIII)21,41で免疫標識した。神経細胞培養を解析する際に、長さを統計的に分析する前にフィルタを適用すると便利であることがわかりました。信号対雑音比が低いため、1μm未満の物体が、繊毛でないものが同定された。そこで、長さが1μm未満のオブジェクトを除去し、繊毛のみを分析するようにデータをフィルタリングしました。培養された視床下部ニューロンでは、繊毛の長さは2μmから7μmの範囲で、平均長さは0.19μm±平均長は3.8μmである(図2B)。興味深いことに、培養海馬神経細胞繊毛は平均長6.73±0.15μmの長さを持つ長さであった(図2C)。視床下部内の異なる神経核は、異なる繊毛長を示し、これらの繊毛は、核特異的な方法で生理学的変化に応答してそれらの長さを変化することが報告されている19,23.そこで、ACIIIを有する成人雄C57BL/6Jマウスの視床下部脳切片に標識し、円弧核(ARC)およびパラベンチキュラー核(PVN)を画像化した。GA3を用いて繊毛の長さを測定し、インビボ視床下部繊毛がインビトロ繊毛よりも長く現れたことを観察した。具体的には、視床下部の視床下部のインビボの範囲は1μmから約15μm(図3)までである。PVN(5.54±0.0.42 μm)とARC(6.16±0.27 μm)の繊毛の長さとの間に有意な差はなかった(図3C)23。同様に、海馬のコルヌアンモニス(CA1)領域の繊毛は、平均長さ5.28±0.33μmの1μmから10μmまでの狭い長さの範囲を表示する(図3)。以前に発表された研究に従って、AiとGA3ツールを用いた分析は、異なる脳領域からの繊毛が長さ19、23の多様性を示していることを示した。また、このAiアプローチを用いて、多数の繊毛を迅速に評価することができる。 GA3を用いた繊毛組成の測定一次シリウムは、さまざまな種類のタンパク質を利用して、モータタンパク質、フラベラ輸送タンパク質およびGPCRsなどのユニークな機能を実行する多くの経路のシグナル伝達ハブであり、3、24、42、43を挙げています。これらのタンパク質の適切なレベルをシリウム内で維持することは、適切な機能のために重要であり、しばしば細胞のコンテキスト依存性に見える。これらのタンパク質の蛍光標識は、それらを視覚化するだけでなく、比較的小さなコンパートメント20内の標識タンパク質の量の尺度としてそれらの強度を定量化することを可能にした。そこで、我々は、毛様体GPCR、メラニン濃縮ホルモン受容体1(MCHR1)の強度を、成人雄マウス24,44の視床下部のARC及びPVNの両方において生体内で決定することを求めた。AiとGA3を用いて、MCHR1陽性繊毛の長さを強度と共に測定し、計数される物体が繊毛であることを確認した(補助図3A)。長さが2μm未満の事後分析を除去し、残りのバイナリマスクの強度を解析しました。興味深いことに、PVNにおける毛様体MCHR1の強度は、PVNにおける毛様体MCHR1の存在が強いことを示すARCのそれよりも有意に高いことがわかった(図4)。これらの神経回路における毛様体MCHR1の重要性を決定するためには、さらなる研究が必要である。我々はまた、視床下部および海馬の一次培養ニューロンにおける毛様体MCHR1の強度を測定した。両培養物の繊毛は、異種ニューロン集団の存在を示唆するMCHR1強度の広い分布を示す(補足図2)。このように、AiやGA3のような洗練された分析ツールを使用することで、同じ組織内または複数の組織間の繊毛異質性の評価が可能になります。他の神経細胞GPCが同じ組織のニューロン内の局在に同様の違いを示しているかどうか、そしてこれが生理学的変化に応じて変化するかどうかは興味深いでしょう。 コローカリゼーション画像分野全体で蛍光強度を測定すると、タンパク質の印象が得られますが、空間分布や他の近くのタンパク質や細胞構造への近接などの情報を提供することができません。ここでは、各バイナリマスクに対してMCHR1の強度をACIIIに対してプロットして、ACIIIを繊毛マーカーとしてMCHR1との重なり合いを測定した(図5)。グラフは、繊毛の大部分がACIIIとMCHR1の両方で正であることを示していますが、一部の繊毛は他方のチャネルの強い表現を示しています。さらに、X軸とy軸に直接位置する点から明らかなようにACIIIまたはMCHR1の存在を示す繊毛もある。この重複を定量化するために、マンダーの重なり係数を測定し、ARCとPVN40の神経膜繊毛におけるMCHR1発現の程度を比較した。興味深いことに、我々の分析は、PVNの係数(0.6382 ± 0.0151)がARC(0.5430±0.0181)の係数よりも有意に増加したことを明らかにした(図5C)。これは、ARCと比較してPVNでMCHR1強度が高い観測を行った以前のデータと一致しています(図4)。このデータは、繊毛の長さと同様に、毛様体内のMCHR1の発現パターンが脳の異なる領域で変化することを示唆している。同じ分析パイプラインを用いて、神経ペプチドY受容体2型(NPY2R)およびソマトスタチン受容体3(SSTR3)のような他の毛様体GPDRが同様の量の多様性を示すかどうかを判断することが可能となる。 シリウムに沿った強度プロファイルの測定segment.ai を使用して繊毛が特定されると、GA3レシピを変更して、画像に関心のある他の構造の同定と繊毛分析を組み合わせることができます。たとえば、基底体マーカーによるラベリングは、繊毛極性の識別に役立ちます。この分析を行うために、ARL13B-mCherryおよびCentrin2-GFPを発現するP0マウスの視床下部脳切片を画像化し、ARCおよびPVN34を画像化した。ここでは、以前のようにAiを用いて繊毛を同定したが、現在、修飾GA3レシピには、繊毛の基部に見られるセントリオラータンパク質であるCentrin2-GFPの同定が含まれている(補助図3B)。Centrin2-GFPにラベルを付けることで、繊毛の基盤はARL13B-mCherry陽性繊毛の先端と区別することができる(図6A)。そして、繊毛全体の強度を測定する代わりに、繊毛の長さに沿ったARL13B強度の変化を測定することができる(図6B)。また、繊毛の近位端と遠位端の間のARL13Bの強度の違いを比較することもできます。これを行うために、シリウム長をベースから始まる1ミクロンビンに分割し、最初のミクロンビンを近位端に、最後のミクロンビンを遠位端として指定しました。我々の分析は、ARCおよびPVNの両方においてシリウムの先端よりも基部にかなり多くのARL13B存在があることを明らかにし、これはヒト軟骨細胞45(図6C)で以前に発表された研究と一致している。このタイプの解析では、長さフィルターを適用して小さな非毛様体系オブジェクトを分析から除外する代わりに、Centrin2-GFP ラベリングに関連する繊毛のみが分析されます。これは、遺伝子変異が非常に短い繊毛をレンダリングする状況や、遷移ゾーンや先端のような繊毛サブドメインの変化が関係している場合に有利です。AiおよびGA3分析を用いた繊毛の同定は、適応性が高く、様々な複雑な研究課題に合わせて調整することができます。 図 1.Aiを用いて繊毛の長さと強度を測定するためのワークフロー。(A) Ai を訓練するために、生のトレーニング画像上の対象物(繊毛)の周りにバイナリが描画されます。セグメント Ai は、描画されたバイナリを使用して、繊毛の形状とピクセルの強度を認識するようにトレーニングされます。(B)次に、訓練されたセグメントAiを生実験画像に適用する。これは、繊毛として認識されるオブジェクトにバイナリを描画します。これらのバイナリは、すべての繊毛のみが分析されていることを確認するために改良することができます。(C) Ai が認識するオブジェクトの強度と長さを分析するために GA3 プログラムが構築されます。(D) レコードはソフトウェアのテーブルにインポートされます。このテーブルは、さらに分析するためにエクスポートできます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2.インビトロ繊毛長測定。(A)IMCD細胞(緑色、アセチル化チューブリン)(B)の主要視床下部培養(緑色、ACIII)および(C)海馬培養物(緑色、ACIII)における代表的な画像。訓練を受けたAiは、バイナリマスク(マゼンタ)に示すように繊毛を認識するために使用され、その後、GA3を使用して繊毛の長さを測定した。繊毛長の分布は、0.5または1.0ミクロンビンにおける繊毛の割合としてグラフ化されます。*は、サイトキネティックブリッジがAiによって正しく認識されないことを示します。3つの複製からIMCD細胞のn=225繊毛、視床下部の54の繊毛および3つの動物からの海馬培養の139の繊毛。スケールバー 10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 3.インビボ 繊毛長測定。 (A) 成人マウス脳部のARC、PVN、CA1における繊毛(緑色、ACIII)の代表的な画像。(B) NIS要素の訓練を受けた Ai は、バイナリマスク(マゼンタ)に示すように繊毛を認識するために使用され、その後GA3を使用して繊毛の長さを測定した。(C)繊毛の長さの分布は、1ミクロンビンにおける繊毛の割合としてグラフ化される。アークではn=68繊毛、PVNでは36、CA1では3匹から29個。スケールバー 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 4.視床下部神経小体 の繊毛の繊毛染色強度測定を支援した。(A)成人マウス脳部のARCおよびPVNにおける繊毛(MCHR1、赤色)の代表的な画像。NIS要素の訓練を受けたAiは、バイナリマスク(シアン)に示すように繊毛を認識するために使用され、GA3は繊毛中のMCHR1染色の強度を測定するために使用された。(B) MCHR1 強度は平均± S.E.Mとしてグラフ化されます。各ドットは、シリウムを表します。* p < 0.05, 学生のtテスト.(C)MCHR1強度の分布は、0.2 x 107 任意単位(A.U.)のビン内の繊毛の割合としてグラフ化されます。アークではn= 53繊毛、3動物からPVNで78。スケールバー 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 5.Aiは、繊毛共局在解析を支援した。 (A, B)ARCおよびPVNにおける繊毛の代表的な画像。繊毛にはACIII(緑)とMCHR1(赤)のラベルが付いています。NISエレメントの訓練を受けたAiは、バイナリマスク(ACIIIラベル付き繊毛のマゼンタ、MCHR1ラベル付き繊毛のシアン)に示すように繊毛を認識するために使用されました。GA3は、ACIIIとMCHR1の両方を含む繊毛を認識するために使用された。(C)Mandersオーバーラップ係数(MOC)値は、平均±S.E.Mとしてグラフ化されます。各ドットは、シリウムを表します。* p < 0.05, 学生のtテスト.(D) ARC および PVN における MCHR1 強度対 ACIII 強度の散布図。各ドットは、シリウムを表します。アークではn=72繊毛、3動物からPVNで47。スケールバー 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 6.繊毛と大脳の体の分析。(A)P0マウスのARCおよびPVNにおける繊毛(赤、ARL13B-mCherry)および基底体マーカー(緑、セントリン2-GFP)の代表的な画像。訓練を受けたAiは、バイナリマスク(シアン)に示すように繊毛を認識するために使用された。基礎体(マゼンタ)のバイナリマスクは、GA3レシピの閾値によって描かれました。(B)シリウムの代表的なラインスキャン強度。(C)Arl13Bの近位および遠位端での強度は、平均±S.E.Mとしてグラフ化された繊毛を同定した。近位端と遠位端は、シリウムの基部からそれぞれ最初の1μmの長さと最後の1μmの長さの領域として定義されます。各ドットは、シリウムを表します。* p < 0.05.n= 3動物由来の2動物及びPVN中21個の繊毛からARCで6個の繊毛を含む。スケールバー 10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補助図 1.Aiトレーニングロスグラフ。(A, B)インビトロおよび生体内の神経細胞の繊毛における segment.ai のトレーニング損失を示すグラフ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補助図 2.Aiは 、インビトロ 神経性繊毛の強度測定を染色するCiliaを支援しました。(A, B)主要視床下部および海馬培養における繊毛(MCHR1、赤)の代表的な画像をそれぞれ示す。NIS要素の訓練を受けたAiは、バイナリマスク(シアン)に示すように繊毛を認識するために使用され、GA3は繊毛中のMCHR1染色の強度を測定するために使用された。MCHR1強度の分布は、視床下部の1000 A.U.ビンと海馬培養のための2000 A.U.ビンにおける繊毛の割合としてグラフ化される。n= 視床下部で30繊毛、海馬培養で106の繊毛を3匹から。スケールバー10 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補助図 3.繊毛分析のための一般分析3レシピ。(A)繊毛の長さ、強度、マンダー係数の測定のための簡単な一般分析 (GA3) レシピ。(B)基底体のマーカーを使用してシリウムの長さに沿って強度の測定のための複雑なGA3レシピ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。