Approches de l’intelligence artificielle pour évaluer les cils primaires

Former l’IA pour identifier les cilsMesurer et évaluer la longueur structurelle et la composition des cils peut être un processus fastidieux, long et sujet aux erreurs. Ici, nous utilisons Ai pour segmenter avec précision les cils à partir d’un grand nombre d’images et analyser leurs longueurs et intensités avec un outil d’analyse(Figure 1). Toutes les approches d’IA nécessitent des étapes de formation pour leur mise en œuvre. Nous avons établi un pipeline de formation pour reconnaître les cils, qui a été effectué en appliquant manuellement des masques binaires sur des structures ciliaires. Ces informations sont ensuite utilisées pour entraîner l’IA en fonction des caractéristiques des pixels sous les binaires appliqués. En règle générale, la formation implique que le logiciel passe par plusieurs itérations, environ 1000, et est considérée comme optimale si le taux de perte ou d’erreur de formation est inférieur à 1%. Toutefois, le nombre d’itérations et d’erreurs dans le processus de formation peut varier en fonction des exemples d’images utilisés pour la formation. Par exemple, après nos séances d’entraînement utilisant des images de cils neuronaux in vitro, le taux d’erreur était de 1,378% contre 3,36% pour les images de section cérébrale in vivo (Figure supplémentaire 1). Une fois la formation terminée, l’IA peut ensuite être utilisée pour segmenter les cils à partir d’images expérimentales en quelques secondes et les masques binaires résultants sont utilisés pour mesurer les paramètres structurels. Cela élimine le besoin de segmenter les objets en utilisant la méthode traditionnelle de seuil d’intensité, ce qui peut être difficile dans les images avec un bruit de fond élevé ou lorsque les objets sont à proximité les uns des autres. Ai réduit également le potentiel d’erreur et de biais en appliquant le même algorithme à toutes les images, quel que soit l’utilisateur. Mesure de la longueur des cils à l’aide de GA3La longueur des cils est étroitement régulée et est associée à des impacts fonctionnels sur la signalisation ciliaire16,19. Ici, nous avons mesuré les longueurs de cils à l’aide d’un pipeline d’analyse dans le logiciel NIS Elements appelé General Analysis 3 ou GA3. GA3 aide à combiner plusieurs outils dans un seul flux de travail pour créer des routines personnalisées pour chaque expérience. Nous avons commencé par mesurer la longueur des cils dans une lignée cellulaire. Les cils sur les cellules du canal collecteur médullaire interne (IMCD-3) de souris ont été immunomarqués avec de la tubuline acétylée et imagés à l’aide d’un microscope confocal. Nous avons mesuré les longueurs des cils à l’aide de GA3 après segmentation avec segment.ai (Figure supplémentaire 3A). Alors que la α-tubuline acétylée se trouve préférentiellement dans le cilium primaire, on la trouve également dans d’autres régions riches en microtubules telles que le cytosquelette ainsi que le pont cytocinétique. L’IA entraînée a correctement identifié les cils dans l’image, mais pas d’autres structures positives à la tubuline acétylée non ciliaire. Les cils sur cellules IMCD variaient de 0,5 μm à 4,5 μm avec une longueur moyenne de 1,8 ± 0,04 μm(Figure 2A). Nous avons ensuite testé la capacité de l’IA à mesurer la longueur des cils dans les cultures neuronales primaires. Nous avons cultivé des neurones de l’hypothalamus et de l’hippocampe de souris néonatales pendant 10 jours et les avons immunomarqués avec le marqueur des cils adénylate cyclase III (ACIII)21,41. Lors de l’analyse des cultures neuronales, nous avons trouvé utile d’appliquer un filtre avant d’analyser statistiquement les longueurs. En raison d’un rapport signal/bruit plus faible, plusieurs objets de moins de 1 μm qui n’étaient pas des cils ont été identifiés. Par conséquent, nous avons filtré les données pour éliminer tous les objets de moins de 1 μm de longueur afin de nous assurer que seuls les cils étaient analysés. Dans les neurones hypothalamiques cultivés, les longueurs des cils variaient de 2 μm à 7 μm avec une longueur moyenne de 3,8 ± 0,19 μm(Figure 2B). Fait intéressant, les cils neuronaux de l’hippocampe cultivés étaient plus longs avec une longueur moyenne de 6,73 ±0,15 μm(figure 2C). Il a été rapporté que différents noyaux neuronaux dans l’hypothalamus présentent des longueurs de cils distinctes et que ces cils modifient leur longueur en réponse à des changements physiologiques d’une manière spécifique au noyau19,23. Par conséquent, nous avons également marqué des sections cérébrales hypothalamiques de souris mâles adultes C57BL / 6J avec ACIII et imagé le noyau arqué (ARC) et le noyau paraventriculaire (PVN). En utilisant GA3 pour mesurer la longueur des cils, nous avons observé que les cils hypothalamiques in vivo semblaient plus longs que les cils in vitro. Plus précisément, les cils hypothalamiques in vivo vont de 1 μm à environ 15 μm(figure 3). Il n’y avait pas de différences significatives entre les longueurs de cils dans le PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) et celles dans l’ARC (6,16 ± 0,27 μm)(Figure 3C)23. De même, les cils de la région cornu ammonis (CA1) de l’hippocampe présentent une plage de longueur plus étroite allant de 1 μm à 10 μm avec une longueur moyenne de 5,28 ± 0,33 μm(Figure 3). Conformément à des études publiées précédemment, notre analyse utilisant des outils Ai et GA3 a montré que les cils de différentes régions du cerveau présentent une diversité de longueur19,23. De plus, en utilisant cette approche d’IA, nous sommes en mesure d’évaluer rapidement un grand nombre de cils. Mesure de la composition des cils à l’aide de GA3Le cilium primaire est un centre de signalisation pour de nombreuses voies qui utilisent divers types de protéines pour remplir des fonctions uniques telles que les protéines motrices, les protéines de transport intraflagelaires et les RCPG pour n’en nommer quequelques-unes3,24,42,43. Le maintien des niveaux appropriés de ces protéines dans le cilium est important pour le bon fonctionnement et semble souvent dépendre du contexte cellulaire. Le marquage fluorescent de ces protéines nous a non seulement permis de les visualiser, mais aussi de quantifier leurs intensités en tant que mesure de la quantité de protéine marquée dans le compartiment relativement petit20. Par conséquent, nous avons cherché à déterminer les intensités d’un RCPG ciliaire, le récepteur 1 de l’hormone de concentration de la mélanine (MCHR1), in vivo dans l’ARC et le PVN de l’hypothalamus de souris mâles adultes24,44. En utilisant Ai et GA3, nous avons mesuré les longueurs des cils positifs MCHR1 ainsi que les intensités pour nous assurer que les objets comptés étaient des cils(figure supplémentaire 3A). Nous avons éliminé les objets post-analyse dont la longueur était inférieure à 2 μm et analysé les intensités des masques binaires restants. Fait intéressant, nous avons constaté que l’intensité de MCHR1 ciliaire dans le PVN est significativement plus élevée que celle dans l’ARC, ce qui indique une présence plus forte de MCHR1 ciliaire dans le PVN(Figure 4). D’autres études sont nécessaires pour déterminer l’importance de MCHR1 ciliaire dans ces circuits neuronaux. Nous avons également mesuré les intensités de MCHR1 ciliaire dans les neurones de culture primaire de l’hypothalamus et de l’hippocampe. Les cils des deux cultures présentent une large distribution des intensités MCHR1 suggérant la présence de populations neuronales hétérogènes (Figure supplémentaire 2). Ainsi, l’utilisation d’outils analytiques sophistiqués tels que Ai et GA3 permet d’évaluer l’hétérogénéité des cils au sein d’un même tissu ou entre plusieurs tissus. Il sera intéressant de voir si d’autres RCPG neuronaux présentent des différences similaires dans leur localisation au sein des neurones du même tissu et si cela change en réponse à des changements physiologiques. ColocalisationBien que la mesure des intensités de fluorescence dans un champ d’image complet puisse donner une impression de protéine, elle ne fournit pas d’informations telles que la distribution spatiale ou la proximité d’autres protéines et structures cellulaires voisines. Ici, nous avons mesuré le chevauchement de MCHR1 avec ACIII comme marqueur de cils en traçant les intensités de MCHR1 par rapport à celles d’ACIII pour chaque masque binaire (Figure 5). Le graphique montre que la majorité des cils sont positifs pour les deux, ACIII et MCHR1, bien que certains cils montrent une expression plus forte d’un canal par rapport à l’autre. En outre, il y a quelques cils qui montrent la présence de ACIII ou MCHR1 comme en témoignent les points qui se trouvent directement sur l’axe des x et l’axe des y respectivement. Pour quantifier ce chevauchement, nous avons mesuré le coefficient de chevauchement de Mander et comparé l’étendue de l’expression de MCHR1 dans les cils neuronaux de l’ARC et du PVN40. Fait intéressant, notre analyse a révélé qu’il y avait une augmentation significative des coefficients du PVN (0,6382 ± 0,0151) par rapport à ceux de l’ARC (0,5430 ± 0,0181)(Figure 5C). Ceci est cohérent avec nos données précédentes où nous avons observé des intensités MCHR1 plus élevées dans le PVN par rapport à l’ARC(Figure 4). Ces données suggèrent que, comme la longueur des cils, le modèle d’expression de MCHR1 dans le compartiment ciliaire varie dans différentes régions du cerveau. En utilisant le même pipeline d’analyse, il sera possible de déterminer si d’autres RCPG ciliaires tels que le récepteur du neuropeptide Y de type 2 (NPY2R) et le récepteur de la somatostatine de type 3 (SSTR3) présentent des quantités similaires de diversité. Mesure du profil d’intensité le long du ciliumUne fois que les cils ont été identifiés à l’aide de segment.ai, la recette GA3 peut être modifiée pour combiner l’analyse des cils avec l’identification d’autres structures d’intérêt dans l’image. Par exemple, l’étiquetage avec des marqueurs du corps basal est utile pour identifier la polarité des cils. Pour effectuer cette analyse, nous avons imagé des sections hypothalamiques du cerveau de souris P0 qui expriment ARL13B-mCherry et Centrin2-GFP et imagé l’ARC et le PVN34. Ici, les cils ont été identifiés en utilisant Ai comme auparavant, mais maintenant la recette GA3 modifiée comprend l’identification de Centrin2-GFP, une protéine centriolaire trouvée à la base des cils (Figure supplémentaire 3B). En étiquetant Centrin2-GFP, la base des cils peut être distinguée des extrémités des cils positifs ARL13B-mCherry (Figure 6A). Ensuite, au lieu de mesurer l’intensité dans l’ensemble des cils, nous sommes en mesure de mesurer les changements d’intensité ARL13B le long de la longueur descils (Figure 6B). Nous pouvons également comparer les différences d’intensité de l’ARL13B entre les extrémités proximales et les extrémités distales des cils. Pour ce faire, nous avons divisé la longueur du ciliium en bacs de 1 micron à partir de la base et désigné le premier bac de microns comme extrémité proximale et le dernier bac de micron comme extrémité distale. Notre analyse a révélé qu’il y a significativement plus d’ARL13B présent plus près de la base que la pointe du cilium dans l’ARC et le PVN, ce qui est cohérent avec les études publiées précédemment dans les chondrocytes humains45 (Figure 6C). Dans ce type d’analyse, au lieu d’appliquer un filtre de longueur pour exclure les petits objets non ciliaires de l’analyse, seuls les cils associés à l’étiquetage Centrin2-GFP sont analysés. Cela peut être avantageux dans les situations où les mutations génétiques rendent les cils très courts, ou si des changements dans les sous-domaines des cils comme la zone de transition ou la pointe ont été impliqués. L’identification des cils à l’aide de l’analyse Ai et GA3 est hautement adaptable et peut être adaptée pour s’adapter à une variété de questions de recherche complexes. Graphique 1. Flux de travail pour mesurer la longueur et l’intensité des cils à l’aide de l’IA. (A) Pour entraîner l’Ai, des binaires sont dessinés autour des objets d’intérêt (cils) sur les images d’entraînement brutes. À l’aide des binaires dessinés, Segment Ai est entraîné à reconnaître la forme et l’intensité des pixels des cils. (B) Ensuite, le segment Ai entraîné est appliqué à des images expérimentales brutes. Il dessine des binaires sur des objets qu’il reconnaît comme des cils. Ces binaires peuvent être affinés pour s’assurer que tous et seulement les cils sont analysés. (C) Un programme GA3 est construit pour analyser l’intensité et la longueur des objets reconnus par l’Ai. (D) Les enregistrements sont importés dans une table du logiciel. Ce tableau peut ensuite être exporté pour une analyse plus approfondie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 2. Mesures in vitro de la longueur des cils. Images représentatives des cils dans (A) les cellules IMCD (vert, tubuline acétylée) (B) les cultures hypothalamiques primaires (vert, ACIII) et (C) les cultures hippocampiques (vertes, ACIII). Un Ai entraîné a été utilisé pour reconnaître les cils comme indiqué dans le masque binaire (magenta), puis GA3 a été utilisé pour mesurer la longueur des cils. La distribution de la longueur des cils est représentée graphiquement en pourcentage de cils dans des bacs de 0,5 ou 1,0 micron. * indique un pont cytocinétique correctement non reconnu par Ai. n = 225 cils dans les cellules IMCD de 3 répliques, 54 cils dans l’hypothalamique et 139 cils dans les cultures hippocampiques de 3 animaux. Barres d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Graphique 3. Mesures in vivo de la longueur des cils. (A) Images représentatives des cils (verts, ACIII) dans l’ARC, le PVN et le CA1 des sections du cerveau de souris adultes. (B) Un Ai entraîné dans les éléments NIS a été utilisé pour reconnaître les cils comme indiqué dans le masque binaire (magenta), puis GA3 a été utilisé pour mesurer la longueur des cils. (C) La distribution de la longueur des cils est représentée graphiquement en pourcentage de cils dans des bacs d’un micron. n= 68 cils en ARC, 36 en PVN et 29 en CA1 de 3 animaux. Barres d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Graphique 4. Ai a aidé les mesures d’intensité de coloration des cils des cils neuronaux hypothalamiques. (A) Images représentatives des cils (MCHR1, rouge) dans l’ARC et le PVN des sections du cerveau de souris adultes. Un Ai entraîné dans les éléments NIS a été utilisé pour reconnaître les cils comme indiqué dans le masque binaire (cyan), puis GA3 a été utilisé pour mesurer l’intensité de la coloration MCHR1 dans les cils. (B) Les intensités MCHR1 sont représentées sous forme de ± S.E.M. Chaque point représente un cilium. * p < 0,05, Test t de Student. (C) La distribution de l’intensité MCHR1 est représentée graphiquement en pourcentage de cils dans des bacs de 0,2 x 107 unités arbitraires (A. U.). n= 53 cils en ARC, 78 en PVN de 3 animaux. Barres d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Graphique 5. Ai assisté l’analyse de colocalisation des cils. (A, B) Images représentatives des cils dans l’ARC et le PVN respectivement. Les cils sont étiquetés ACIII (vert) et MCHR1 (rouge). Un Ai entraîné dans les éléments NIS a été utilisé pour reconnaître les cils comme indiqué dans le masque binaire (magenta pour les cils marqués ACIII, cyan pour les cils marqués MCHR1). GA3 a été utilisé pour reconnaître les cils qui contenaient à la fois ACIII et MCHR1. (C) Les valeurs du coefficient de chevauchement (MOC) de Manders sont représentées sous forme de ± S.E.M. Chaque point représente un cilium. * p < 0,05, Test t de Student. (D) Nuage de points de l’intensité MCHR1 par rapport à l’intensité ACIII en ARC et PVN. Chaque point représente un cilium. n= 72 cils en ARC, 47 en PVN de 3 animaux. Barres d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Graphique 6. Analyse des cils et du corps basal. (A) Images représentatives des cils (rouge, ARL13B-mCherry) et du marqueur corporel basal (vert, Centrin2-GFP) dans l’ARC et le PVN de souris P0. Une IA entraînée a été utilisée pour reconnaître les cils comme indiqué dans le masque binaire (cyan). Le masque binaire pour le corps basal (magenta) a été dessiné par seuil dans la recette GA3. (B) Intensité représentative du balayage linéaire d’un ciliium. (C) Intensités ARL13B aux extrémités proximale et distale de l’Ai identifiées comme étant représentées graphiquement comme moyennes ± S.E.M. Les extrémités proximale et distale sont définies comme la région située respectivement dans la première longueur de 1 μm et la dernière longueur de 1 μm à partir de la base du cilium. Chaque point représente un cilium. * p < 0,05. n = 6 cils en ARC de 2 animaux et 21 cils en PVN de 3 animaux. Barres d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure supplémentaire 1. Graphiques de perte d’entraînement Ai. (A, B) Graphiques montrant la perte d’entraînement des segment.ai sur les cils neuronaux in vitro et in vivo, respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 2. Ai Assisted Cilia mesures de l’intensité de coloration des cils neuronaux in vitro. (A, B) Images représentatives des cils (MCHR1, rouge) dans les cultures hypothalamique et hippocampique primaires, respectivement. Un Ai entraîné dans les éléments NIS a été utilisé pour reconnaître les cils comme indiqué dans le masque binaire (cyan), puis GA3 a été utilisé pour mesurer l’intensité de la coloration MCHR1 dans les cils. La distribution de l’intensité MCHR1 est représentée graphiquement en pourcentage de cils dans 1000 bacs A.U. pour les bacs hypothalamiques et 2000 bacs A.U. pour les cultures hippocampiques. n= 30 cils en hypothalamique et 106 cils en cultures hippocampiques de 3 animaux. Barres d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 3. Analyse générale 3 recettes pour l’analyse des cils. (A) Recette d’analyse générale simple (GA3) pour la mesure de la longueur des cils, de l’intensité et du coefficient de Mander. (B) Recette complexe GA3 pour la mesure de l’intensité le long de la longueur du cil à l’aide d’un marqueur pour le corps basal. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.