Подходы искусственного интеллекта к оценке первичных ресничек

Обучение ИИ для идентификации ресничекИзмерение и оценка структурной длины и состава ресничек может быть утомительным, трудоемким и подверженным ошибкам процессом. Здесь мы используем Ai для точного сегментирования ресничек из большого пула изображений и анализа их длины и интенсивности с помощью инструмента анализа(рисунок 1). Все подходы КИ требуют учебных шагов для их реализации. Мы создали обучающий конвейер для распознавания ресничек, который выполнялся путем ручного нанесения бинарных масок на цилиарные структуры. Эта информация затем используется для обучения Ai на основе характеристик пикселей в примененных двоичных файлах. В качестве общего ориентира, обучение включает в себя программное обеспечение, проходящее через несколько итераций, примерно 1000, и считается оптимальным, если частота потерь или ошибок обучения составляет менее 1%. Однако количество итераций и ошибок в процессе обучения может варьироваться в зависимости от образцов изображений, используемых для обучения. Например, после наших тренировок с использованием изображений ресничек нейронов in vitro частота ошибок составила 1,378% по сравнению с 3,36% для изображений разреза мозга in vivo (дополнительный рисунок 1). После завершения обучения ИИ можно использовать для сегментирования ресничек из экспериментальных изображений в течение нескольких секунд, а результирующие бинарные маски используются для измерения структурных параметров. Это устраняет необходимость сегментировать объекты с использованием традиционного метода порогов интенсивности, который может быть затруднен на изображениях с высоким фоновым шумом или когда объекты находятся в непосредственной близости друг от друга. Ai также снижает вероятность ошибок и смещений, применяя один и тот же алгоритм ко всем изображениям, независимо от пользователя. Измерение длины ресничек с помощью GA3Длина ресничек жестко регулируется и связана с функциональным воздействием на цилиарную сигнализацию16,19. Здесь мы измерили длину ресничек с помощью конвейера анализа в программном обеспечении NIS Elements под названием General Analysis 3 или GA3. GA3 помогает объединить несколько инструментов в одном рабочем процессе для создания настраиваемых процедур для каждого эксперимента. Мы начали с измерения длины ресничек в клеточной линии. Реснички на клетках внутреннего медуллярного собирательного протока мыши (IMCD-3) были иммуномаркированы ацетилированным тубулином и визуализированы с помощью конфокального микроскопа. Мы измерили длину ресничек с помощью GA3 после сегментации с segment.ai(дополнительный рисунок 3A). В то время как ацетилированный α-тубулин предпочтительно находится в первичной ресничке, он также встречается в других областях, богатых микротрубочками, таких как цитоскелет, а также цитокинетический мост. Обученный Аи правильно идентифицировал реснички на изображении, но не другие нецилиарные, ацетилированные тубулиновые положительные структуры. Реснички на клетках IMCD варьировались от 0,5 мкм до 4,5 мкм со средней длиной 1,8 ± 0,04 мкм(рисунок 2А). Затем мы проверили способность ИИ измерять длину ресничек в первичных нейронных культурах. Мы культивировали нейроны из гипоталамуса и гиппокампа неонатальных мышей в течение 10 дней и иммуномаркировали их маркером ресничек аденилатциклазой III (ACIII)21,41. При анализе нейронных культур мы сочли полезным применить фильтр перед статистическим анализом длин. Из-за более низкого отношения сигнал/шум было идентифицировано несколько объектов размером менее 1 мкм, которые не были ресничками. Поэтому мы отфильтровали данные, чтобы исключить любые объекты длиной менее 1 мкм, чтобы гарантировать, что анализируются только реснички. В культивируемых гипоталамических нейронах длина ресничек варьировалась от 2 мкм до 7 мкм со средней длиной 3,8 ± 0,19 мкм(рисунок 2B). Интересно, что культивируемые реснички нейронов гиппокампа были длиннее со средней длиной 6,73 ±0,15 мкм(рисунок 2C). Сообщалось, что различные ядра нейронов в гипоталамусе имеют различную длину ресничек и что эти реснички изменяют свою длину в ответ на физиологические изменения определенным образом ядра19,23. Поэтому мы также пометили участки гипоталамического мозга у взрослых самцов мышей C57BL/6J с помощью ACIII и визуализировали дугообразное ядро (ARC) и паравентрикулярное ядро (PVN). Используя GA3 для измерения длины ресничек, мы заметили, что in vivo гипоталамические реснички оказались длиннее, чем реснички in vitro. В частности, гипоталамические реснички in vivo варьируются от 1 мкм до примерно 15 мкм(рисунок 3). Не было выявлено существенных различий между длинами ресничек в PVN (5,54 ± 0,0,42 мкм) и в ARC (6,16 ± 0,27 мкм)(рисунок 3C)23. Аналогичным образом, реснички в области cornu ammonis (CA1) гиппокампа имеют более узкий диапазон длины от 1 мкм до 10 мкм со средней длиной 5,28 ± 0,33 мкм(рисунок 3). В соответствии с ранее опубликованными исследованиями, наш анализ с использованием инструментов Ai и GA3 показал, что реснички из разных областей мозга показывают разнообразие по длине19,23. Более того, используя этот подход Ai, мы можем быстро оценить большое количество ресничек. Измерение состава ресничек с помощью GA3Первичная ресничка является сигнальным центром для многих путей, которые используют различные типы белков для выполнения уникальных функций, таких как моторные белки, внутрифлягеллярные транспортные белки иGPCR,чтобы назвать несколько3,24,42,43. Поддержание соответствующих уровней этих белков в ресничке важно для правильного функционирования и часто зависит от клеточного контекста. Флуоресцентная маркировка этих белков не только позволила нам визуализировать их, но и количественно оценить их интенсивность в качестве меры количества меченого белка в относительно небольшом отсеке20. Поэтому мы стремились определить интенсивность цилиарного GPCR, рецептора концентрационного гормона меланина 1 (MCHR1), in vivo как в ARC, так и в PVN гипоталамуса взрослых самцов мышей24,44. Используя Ai и GA3, мы измерили длину положительных ресничек MCHR1 вместе с интенсивностью, чтобы убедиться, что подсчитываемые объекты были ресничками(дополнительный рисунок 3A). Мы исключили объекты после анализа, которые были менее 2 мкм в длину, и проанализировали интенсивности оставшихся бинарных масок. Интересно, что мы обнаружили, что интенсивность цилиарного MCHR1 в PVN значительно выше, чем в ARC, что указывает на более сильное присутствие цилиарного MCHR1 в PVN(рисунок 4). Необходимы дальнейшие исследования для определения значимости цилиарного MCHR1 в этих нейронных цепях. Мы также измерили интенсивность цилиарного MCHR1 в первичных культивируемых нейронах гипоталамуса и гиппокампа. Реснички из обеих культур демонстрируют широкое распределение интенсивностей MCHR1, что свидетельствует о наличии гетерогенных нейронных популяций(дополнительный рисунок 2). Таким образом, использование сложных аналитических инструментов, таких как Ai и GA3, позволяет оценить гетерогенность ресничек в одной ткани или между несколькими тканями. Будет интересно посмотреть, показывают ли другие нейронные GPCR аналогичные различия в их локализации в нейронах той же ткани и изменяется ли это в ответ на физиологические изменения. КолокализацияХотя измерение интенсивности флуоресценции в полном поле изображения может создать впечатление белка, оно не может предоставить такую информацию, как пространственное распределение или близость к другим близлежащим белкам и клеточным структурам. Здесь мы измерили перекрытие MCHR1 с ACIII в качестве маркера ресничек, построив интенсивность MCHR1 против интенсивности ACIII для каждой двоичной маски(рисунок 5). График показывает, что большинство ресничек являются положительными как для ACIII, так и для MCHR1, хотя некоторые реснички показывают более сильную экспрессию одного канала над другим. Кроме того, есть некоторые реснички, которые показывают присутствие ACIII или MCHR1, что видно из точек, которые лежат непосредственно на оси x и оси Y соответственно. Чтобы количественно оценить это перекрытие, мы измерили коэффициент перекрытия Мандера и сравнили степень экспрессии MCHR1 в нейронных ресничках ARC и PVN40. Интересно, что наш анализ показал, что произошло значительное увеличение коэффициентов PVN (0,6382 ± 0,0151), чем в ARC (0,5430 ± 0,0181)(рисунок 5C). Это согласуется с нашими предыдущими данными, где мы наблюдали более высокие интенсивности MCHR1 в PVN по сравнению с ARC(рисунок 4). Эти данные свидетельствуют о том, что, как и длина ресничек, паттерн экспрессии MCHR1 в цилиарном компартменте варьируется в разных областях мозга. Используя тот же конвейер анализа, можно будет определить, показывают ли другие цилиарные GPCR, такие как нейропептидный рецептор Y типа 2 (NPY2R) и рецептор соматостатина типа 3 (SSTR3), аналогичные количества разнообразия. Измерение профиля интенсивности вдоль ресничкиПосле того, как реснички были идентифицированы с использованием segment.ai, рецепт GA3 может быть изменен для объединения анализа ресничек с идентификацией других структур, представляющих интерес на изображении. Например, маркировка базальными маркерами тела полезна для идентификации полярности ресничек. Чтобы сделать этот анализ, мы изобразили участки гипоталамического мозга у мышей P0, которые экспрессируют ARL13B-mCherry и Centrin2-GFP, и изобразили ARC и PVN34. Здесь реснички были идентифицированы с использованием Ai, как и раньше, но теперь модифицированный рецепт GA3 включает идентификацию Centrin2-GFP, центриолярного белка, обнаруженного в основании ресничек(дополнительный рисунок 3B). По маркировке Centrin2-GFP основание ресничек можно отличить от кончиков ARL13B-mCherry положительных ресничек(рисунок 6A). Затем, вместо того, чтобы измерять интенсивность во всех ресничках, мы можем измерить изменения интенсивности ARL13B по длине ресничек(рисунок 6B). Мы также можем сравнить различия в интенсивности ARL13B между проксимальными концами и дистальными концами ресничек. Для этого мы разделили длину ресницы на 1-микронные бункеры, начиная с основания, и обозначили первый микронный бункер как проксимальный конец, а последний микронный бункер как дистальный конец. Наш анализ показал, что ближе к основанию присутствует значительно больше ARL13B, чем кончик ресничек как в ARC, так и в PVN, и это согласуется с ранее опубликованными исследованиями на хондроцитах человека45 (рисунок 6C). В этом типе анализа вместо применения фильтра длины для исключения небольших нецилярных объектов из анализа анализируются только реснички, связанные с маркировкой Centrin2-GFP. Это может быть выгодно в ситуациях, когда генетические мутации приводят к очень коротким ресничкам, или если были вовлечены изменения в поддоменах ресничек, таких как переходная зона или кончик. Идентификация ресничек с помощью анализа Ai и GA3 легко адаптируется и может быть адаптирована к различным сложным исследовательским вопросам. Рисунок 1. Рабочий процесс для измерения длины и интенсивности ресничек с помощью Ai. (A) Для обучения Ai двоичные файлы рисуются вокруг интересующих объектов (ресничек) на необработанных обучающих изображениях. Используя нарисованные двоичные файлы, сегмент Ai обучается распознавать форму и интенсивность пикселей ресничек. (B) Затем обученный сегмент Ai применяется к необработанным экспериментальным изображениям. Он рисует двоичные файлы на объектах, которые он распознает как реснички. Эти двоичные файлы могут быть уточнены, чтобы убедиться, что анализируются все и только реснички. (C) Программа GA3 построена для анализа интенсивности и длины объектов, распознаваемых Ai. (D) Записи импортируются в таблицу в программном обеспечении. Затем эту таблицу можно экспортировать для дальнейшего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2. Измерение длины ресничек in vitro.  Репрезентативные изображения ресничек в (A)клетках IMCD (зеленый, ацетилированный тубулин)(B),первичных гипоталамических культурах (зеленый, ACIII) и(C)гиппокампальных культурах (зеленый, ACIII). Обученный Ai использовался для распознавания ресничек, как показано в бинарной маске (пурпурный), а затем GA3 использовался для измерения длины ресничек. Распределение длины ресничек отображается в процентах от ресничек в 0,5 или 1,0-микронных бункерах. * указывает на цитокинетический мост, должным образом не распознаваемый Аи. n=225 ресничек в клетках IMCD из 3 реплик, 54 ресничек в гипоталамике и 139 ресничек в культурах гиппокампа от 3 животных. Шкала 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3. Измерение длины ресничек in vivo. (A) Репрезентативные изображения ресничек (зеленый, ACIII) в ARC, PVN и CA1 секций мозга взрослых мышей. (B) Обученный Ai в ЭЛЕМЕНТАХ NIS использовался для распознавания ресничек, как показано в бинарной маске (пурпурный), а затем GA3 использовался для измерения длины ресничек. (C) Распределение длины ресничек отображается как процент ресничек в одномикронных бункерах. n= 68 ресничек в ARC, 36 в PVN и 29 в CA1 у 3 животных. Шкала 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4. Ai помог измерить интенсивность окрашивания ресничек гипоталамических нейронов. (A) Репрезентативные изображения ресничек (MCHR1, красный) в ARC и PVN секций мозга взрослых мышей. Обученный Ai в ЭЛЕМЕНТАХ NIS использовался для распознавания ресничек, как показано в бинарной маске (голубой), а затем GA3 использовался для измерения интенсивности окрашивания MCHR1 в ресничках. (B)Интенсивность MCHR1 отображается как средняя ± S.E.M. Каждая точка представляет собой ресничку. * p < 0,05, T-тест студента. (C)Распределение интенсивности MCHR1 отображается как процент ресничек в бункерах 0,2 x 107 произвольных единиц (A. U.). n= 53 ресничек в ARC, 78 в PVN у 3 животных. Шкала 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5. Анализ колокализации ресничек с помощью искусственного интеллекта. (А, Б) Репрезентативные изображения ресничек в ARC и PVN соответственно. Реснички маркируются ACIII (зеленый) и MCHR1 (красный). Обученный Ai в NIS Elements использовался для распознавания ресничек, как показано в бинарной маске (пурпурный для меченых ACIII ресничек, голубой для меченых MCHR1 ресничек). GA3 использовался для распознавания ресничек, содержащих как ACIII, так и MCHR1. (C)Значения коэффициента перекрытия Мандерса (MOC) отображаются в виде среднего ± S.E.M. Каждая точка представляет собой ресничку. * p < 0,05, T-тест студента. (D)Диаграмма рассеяния интенсивности MCHR1 по сравнению с интенсивностью ACIII в ARC и PVN. Каждая точка представляет собой ресничку. n= 72 ресничек в ARC, 47 в PVN от 3 животных. Шкала 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6. Анализ ресничек и базального тела. (A) Репрезентативные изображения ресничек (красный, ARL13B-mCherry) и базального маркера тела (зеленый, Centrin2-GFP) в ARC и PVN мышей P0. Обученный Ай использовался для распознавания ресничек, как показано в бинарной маске (голубой). Бинарная маска для базального тела (пурпурного) была нарисована путем порога в рецепте GA3. (B) Репрезентативная интенсивность сканирования реснички. (C)Интенсивность ARL13B на проксимальном и дистальном концах Ai идентифицировала реснички, изображенные как средние ± S.E.M. Проксимальный и дистальный концы определяются как область в пределах первой длины 1 мкм и последней длины 1 мкм соответственно от основания реснички. Каждая точка представляет собой ресничку. * p < 0,05. n = 6 ресничек в ARC от 2 животных и 21 ресничка в PVN от 3 животных. Шкала 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок 1. Графики потерь обучения ai. (A, B) Графики, показывающие потерю тренировочных segment.ai на нейронных ресничках in vitro и in vivo соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2. Ai Assisted Cilia окрашивание интенсивности интенсивности in vitro нейрональных ресничек. (А, Б) Репрезентативные изображения ресничек (MCHR1, красный) в первичных гипоталамических и гиппокампальных культурах соответственно. Обученный Ai в ЭЛЕМЕНТАХ NIS использовался для распознавания ресничек, как показано в бинарной маске (голубой), а затем GA3 использовался для измерения интенсивности окрашивания MCHR1 в ресничках. Распределение интенсивности MCHR1 отображается как процент ресничек в 1000 A.U. bins для гипоталамических и 2000 A.U. bins для гиппокампальных культур. n= 30 ресничек в гипоталамике и 106 ресничек в культурах гиппокампа от 3 животных. Шкала баров 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 3. Общий анализ 3 рецепта анализа ресничек. (A) Простой общий анализ (GA3) рецепт для измерения длины ресничек, интенсивности и коэффициента Мандера. (B) Комплексный рецепт GA3 для измерения интенсивности по длине реснички с использованием маркера для базального тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.