Modifiche del metodo Langendorff per l'isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti

La CM singola è uno strumento prezioso e indispensabile negli studi a livello cellulare della funzione cardiaca e delle ^malattie20. Quindi, l’isolamento dei CM vitali dai cuori è il passo iniziale e più cruciale. La qualità delle cellule è uno dei determinanti significativi per condurre esperimenti di successo, specialmente negli esperimenti ottici ed elettrofisiologici. Rispetto ai CM di altri animali, i CM dei roditori sono più vulnerabili all’ischemia e all’ipossia a causa di una maggiore concentrazione di ioni sodio intracellulari, che favorisce l’afflusso di calcio attraverso lo scambiatore Na⁺/^Ca2+21. Inoltre, il numero di AM è di gran lunga inferiore a quello delle VM; pertanto, l’isolamento di successo è estremamente difficile da raggiungere. Il metodo Langendorff è eccellente per isolare le VM dei ^topi22, ma il tasso di successo nell’isolamento degli AM è basso e sono disponibili pochi report. La corretta profondità della cannulazione dell’aorta è anche un fattore essenziale per produrre VM ideali oltre alla temperatura, all’attività enzimatica, al PH e alla qualità dell’acqua utilizzata per la preparazione del tampone. Il principio del metodo Langendorff si basa sulla perfusione retrograda del cuore. Alla perfusione, la valvola aortica è chiusa; in tal modo, il perfusato viene forzato nelle arterie coronarie, fornendo soluzione enzimatica attraverso i rami dei vasi e il tessuto miocardico viene digerito uniformemente. Per ottenere questo tipo di schema di circolazione, l’aorta deve riservare una lunghezza sufficiente per la cannulazione e la legatura, inoltre la punta della cannula non deve penetrare nelle valvole aortiche o bloccare l’ostio CA. Pertanto, è ragionevole ipotizzare che la profondità della cannulazione dell’aorta sia anche associata alla perfusione degli atri, che influenza l’efficacia digestiva degli atri e le rese di AM in modo simile. Il protocollo qui presentato ha confermato l’ipotesi e i passaggi cruciali per ottimizzare la resa cellulare insieme ai suggerimenti sono indicati di seguito.

Nel passaggio 1.9, per fissare meglio l’aorta, si consiglia una cannula smussata da 20 G con una tacca (o una scanalatura circonferenziale) da dove la distanza è di 1 mm dalla punta. Sulla base delle nostre esperienze, la dimensione della cannula che è un po ‘più grande del diametro dell’aorta è stata trovata per impedire alla punta della cannula di perforare le valvole aortiche durante la cannulazione perché l’aorta, facendo affidamento sulla sua elasticità intrinseca, può adattarsi perfettamente alla cannula e produrre attrito, che funge da fattore protettivo quando si sposta in avanti o indietro regolando la profondità della cannulazione. In termini di posizione della tacca, il cuore scivolerà facilmente durante la cannulazione a causa della gravità se è troppo vicino alla punta della cannula. Al contrario, lo spazio per regolare la profondità di cannulazione e la posizione di legatura sarà molto limitato se troppo lontano. Date queste circostanze, il transetto dell’aorta tra l’arteria carotide comune sinistra (come la linea verde nella Figura 2) per garantire che l’aorta sia abbastanza lunga e possa essere cannulata e legata all’aorta ascendente è migliore nel passaggio 3.3. Mentre il transetto all’aorta ascendente, la lunghezza riservata per la cannulazione almeno potrebbe fissare la punta della cannula vicino alla radice aortica e non penetrerà nelle valvole aortiche dopo la legatura. L’anatomia dell’aorta e la misurazione della distanza dalla punta della cannula all’ostio CA indicano che il transetto dell’aorta tra l’arteria carotide comune sinistra è una posizione ideale per ottenere una corretta profondità di cannulazione dell’aorta.

La profondità di cannulazione è risultata essere associata alla perfusione degli atri, che a sua volta funge da indicatore di profondità. La Figura 4 mostra che la perfusione degli atri è buona quando la profondità è all’aorta ascendente ed entrambe le appendici atriali sono gonfiate. Tuttavia, la perfusione degli atri è insufficiente quando la profondità è (o si avvicina) alla radice aortica ed entrambe le appendici atriali sono avvizzite. Il conteggio totale e vitale di AM prodotto dalle appendici atriali gonfiate era più alto (Figura 8). Questi risultati indicano che la profondità di cannulazione dell’aorta può influenzare la perfusione e la digestione degli atri e delle appendici atriali in un certo modo e infine influenzare la resa e la qualità dell’AM. La resa e la qualità dell’AM sono state dedotte come associate alla distribuzione delle navi che riforniscono gli atri. Lo studio di Fernández et ^al.23 ha dimostrato varie anomalie nell’origine e nel decorso della CA del topo. Hanno scoperto che le CA ostia erano altamente variabili e non erano tutte situate nel seno aortico. Alcune CA possono originarsi in modo anomalo da sopra i seni aortici, chiamati ostio ad alto decollo. Alcuni CA possono provenire dallo stesso seno aortico e l’ostio del vaso dell’atrio si trova proprio nelle vicinanze. L’anatomia dell’aorta nel presente studio (Figura 10) è anche coerente con la scoperta di Fernández. Questa potrebbe essere la causa per cui i tentativi di isolare AM con il metodo Langendorff sono stati in gran parte infruttuosi se la profondità di cannulazione non è appropriata. Pertanto, la punta della cannula avrà una maggiore possibilità di bloccare l’ostio del vaso dell’atrio adiacente all’ostio CA se non è disponibile abbastanza spazio tra la punta della cannula e l’ostio CA. Al contrario, la perfusione e la resa cellulare del ventricolo erano difficilmente influenzate finché le valvole aortiche non erano penetrate dalla punta della cannula. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che le CA che forniscono sangue al ventricolo hanno ostia più grande e più origini. Se un ostio è stato occluso dalla cannula, la perfusione del ventricolo può essere compensata da un’altra CA o dalla circolazione collaterale, mentre il vaso sanguigno che alimenta l’atrio è piuttosto piccolo e non ha sostituto. Pertanto, l’influenza della profondità nella cannulazione dell’aorta è importante.

Altri fattori degni di nota e la risoluzione dei problemi nel processo di digestione e conservazione delle cellule sono elencati come segue. In primo luogo, considerare di perfondere la soluzione di Tyrode ossigenata nel passaggio 4.1 per far contrarre il muscolo e pompare il sangue residuo se il sangue negli atri non è stato espulso dopo la legatura dell’aorta. Questo può aiutare a evitare l’effetto negativo di ^{ca2 +} e altri materiali rilasciati dagli eritrociti danneggiati. In secondo luogo, perfondere la soluzione ^ca2+-free in anticipo per dissociare la connessione ed espandere lo spazio tra le cellule può migliorare l’efficacia della digestione enzimatica perché i dischi intercalati tra i CM sono giunzioni intercellulari calcio-dipendenti. Tuttavia, il tempo dovrebbe essere limitato a 3-5 minuti per evitare il fenomeno del paradosso del ^calcio24. Si raccomanda una soluzione enzimatica mista. La collagenasi di tipo II interrompe la rete della matrice extracellulare e la tripsina aiuta a eliminare il materiale granulare che rimane sulla superficie cellulare se la digestione della collagenasi II è incompleta. Ciò garantisce una superficie cellulare liscia, che è fondamentale per formare una guarnizione GΩ nella registrazione del morsetto patch. Tuttavia, la concentrazione di tripsina deve essere controllata nel giusto intervallo per evitare la digestione eccessiva e lesioni cellulari perché può degradare la proteina di membrana. L’uso della sola collagenasi di tipo II per migliorare la resa cellulare può spesso portare a una digestione eccessiva dei tessuti e le CM isolate saranno intolleranti al calcio dopo un’esposizione prolungata alla ^{collagenasi25}. L’uso del 2,3-butandione monoxime (BDM), una sostanza che previene la contrazione spontanea inibendo la miosina ATPasi e prevenendo la formazione di ponti incrociati, è ancora controverso26,27,28,29. Secondo l’esperienza precedente, l’aggiunta di BDM è necessaria per questo protocollo. La soluzione enzimatica viene preparata con la soluzione 1 anche se la soluzione 1 non contiene calcio e il calcio viene aggiunto per attivare l’enzima. Il vantaggio di aggiungere BDM nella soluzione di perfusione include (1) inibire la contrazione dei miociti e ridurre il consumo di ossigeno durante la perfusione della soluzione enzimatica e (2) prevenire l’ipossia dei miociti e migliorare la qualità dei miociti isolati. Alcuni studi hanno riportato che il BDM può avere una potenziale influenza negativa sulle proprietà elettriche cellulari. Tuttavia, i risultati della registrazione del morsetto patch a cellula intera della corrente di sodio non hanno indicato un effetto indesiderato. Nella fase di conservazione cellulare (fase 6), numerosi studi hanno scelto il tampone KB, una soluzione priva di calcio ma ad alta concentrazione di potassio, in cui le cellule possono mantenere uno stato migliore perché si trovano in condizioni polarizzate e a bassa metabolica. Tuttavia, il glicocalice della membrana cellulare si separerà dal doppio strato lipidico in assenza di calcio esogeno per un certo periodo di tempo e la permeabilità della membrana aumenterà, influenzando la successiva analisi funzionale30,31,32.

Tutte le tecniche di isolamento dei miociti possono essere essenzialmente classificate attualmente in digestione a blocchi (un piccolo pezzo di tessuto) in una soluzione enzimatica o perfusione CA con soluzione enzimatica (la perfusione di Langendorff)²². Rispetto al metodo Langendorff, il metodo di digestione dei blocchi è più facile da eseguire ed è anche abitualmente utilizzato per isolare i CM in molti laboratori. Tuttavia, questo metodo produce normalmente una bassa resa di CM di scarsa qualità da tessuti ^adulti22. Inoltre, le cellule isolate con questo metodo potrebbero non essere adatte per condurre esperimenti comparativi. Ad esempio, quando si testano gli effetti farmacologici specifici del tipo di cellula tra AM e VM, l’impatto di diverse condizioni di isolamento non può essere trascurato o escluso. Questo perché il miocardio e la densità tissutale del ventricolo sono molto più spessi e densi di quelli dell’atrio, con conseguenti tempi di digestione e concentrazioni enzimatiche diversi. Inoltre, l’eccessiva agitazione e il pipettaggio del tessuto durante la digestione danneggeranno le cellule e avranno un impatto significativo sugli studi funzionali. Inoltre, molti studi precedenti hanno dimostrato che gli AM sono più vulnerabili al calcio. Tuttavia, gli AM isolati dal protocollo corrente possono essere tolleranti alla reintroduzione del calcio gradiente probabilmente perché il tessuto è facile da rompere alla fine del processo di digestione. Pertanto, il danno meccanico è inferiore, mentre le cellule subirebbero più danni meccanici poiché le fasi del metodo chunk richiedono una rottura ripetuta e centrifuga. Più recentemente, Ackers et ^al.33 hanno riportato un metodo semplificato, privo di Langendorff, per l’isolamento di miociti cardiaci vitali e non miociti. Le VM e i fibroblasti possono essere isolati in modo efficace, ma la quantità di AM non è stata menzionata. Tuttavia, questo protocollo presenta diverse limitazioni. In primo luogo, la distribuzione dei vasi sanguigni cardiaci può avere variazioni per le differenze individuali e il ceppo dei topi, e la profondità di cannulazione raccomandata non può garantire un isolamento AM di successo per ogni volta. In secondo luogo, per coloro che sono nuovi a questa procedura può richiedere una certa quantità di tempo per praticare la transezione dell’aorta e la cannulazione retrograda dell’aorta. Infine, questo metodo non è stato testato in altri modelli di malattie cardiache tranne che in topi sani e anziani. Quindi, richiederà aggiustamenti nelle concentrazioni enzimatiche e nel tempo di digestione a causa dell’estensione della fibrosi del cuore. Lo svantaggio delle diverse condizioni di digestione incontrate nel metodo chunk non sarà un problema nel metodo Langendorff in cui la soluzione enzimatica viene distribuita uniformemente al tessuto dai letti dei vasi.

In sintesi, i protocolli per l’isolamento simultaneo di singoli AM e VM qui descritti hanno dimostrato che la corretta profondità di cannulazione dell’aorta può migliorare efficacemente la perfusione dell’atrio e la resa AM. I CM isolati con questo metodo sono di alta qualità, possiedono una buona tolleranza al calcio e sono stati applicati con successo alla registrazione del patch clamp e alla gestione del calcio (rilascio di ^Ca2+ e misurazione dell’onda ^Ca2+ da parte del sistema IonOptix) nel ^team34. Si prevede che il protocollo di isolamento possa essere utilizzato per la preparazione cellulare in una serie di indagini cellulari e subcellulari, che aiuteranno ad approfondire la comprensione della fisiologia e della patologia cardiaca. È importante sottolineare che consentirà la scoperta di meccanismi e metodi di intervento clinicamente più rilevanti per le malattie cardiache.