Modificações do Método Langendorff para Isolamento Simultâneo de Miócitos Atrial e Ventricular de Camundongos Adultos

O Único CM é uma ferramenta valiosa e indispensável em estudos de nível celular de função cardíaca e ^doenças20. Assim, o isolamento de CMs viáveis dos corações é o passo inicial e mais crucial. A qualidade celular é um dos determinantes significativos da realização de experimentos bem-sucedidos, especialmente em experimentos ópticos e eletrofisiológicos. Em comparação com os CMs de outros animais, os CMs de roedores são mais vulneráveis à isquemia e hipoxia devido a uma maior concentração de íons de sódio intracelulares, o que favorece o fluxo de cálcio através do trocador Na⁺/^Ca2+. Além disso, o número de AMs é muito menor do que o dos VMs; assim, o isolamento bem sucedido é extremamente difícil de alcançar. O método Langendorff é excelente para isolar os ^VMs22 de camundongos, mas a taxa de sucesso em isolar AMs é baixa, e poucos relatórios estão disponíveis. A profundidade adequada da cannulação da aorta também é um fator essencial para produzir VMs ideais além da temperatura, atividade enzimápica, PH e qualidade da água utilizada para a preparação do tampão. O princípio do método Langendorff baseia-se na perfusão retrógrada do coração. Após a perfusão, a válvula aórtica é fechada; assim, o perfusato é forçado para as artérias coronárias, fornecendo solução enzimápica através dos ramos do vaso, e o tecido miocárdio é uniformemente digerido. Para alcançar esse tipo de padrão de circulação, a aorta deve reservar comprimento suficiente para a canulação e a ligadura, também a ponta da cânula não deve penetrar nas válvulas aórticas ou bloquear o ostium CA. Assim, é razoável especular que a profundidade da cannulação da aorta também está associada à perfusão atria, que afeta a eficácia da digestão da atria e os rendimentos do AM de forma semelhante. O protocolo aqui apresentado confirmou a hipótese, e são observados passos cruciais para a otimização do rendimento celular, juntamente com as sugestões.

Na etapa 1.9, para melhor fixar a aorta, recomenda-se uma cânula de 20 G com um entalhe (ou uma ranhura circunferencial) de onde a distância é de 1 mm até a ponta. Com base em nossas experiências, o tamanho da cânula um pouco maior que o diâmetro da aorta foi encontrado para evitar que a ponta da cânula perfurasse as válvulas aórticas durante a cannulação porque a aorta, contando com sua elasticidade intrínseca, pode se encaixar na cânula e produzir atrito, que age como um fator protetor ao se mover para frente ou para trás ajustando a profundidade da cânula. Em termos de posição do entalhe, o coração facilmente escorregará durante a canulação por causa da gravidade se estiver muito perto da ponta da cânula. Por outro lado, o espaço para ajustar a profundidade de cannulação e a posição de ligadura serão muito confinados se for longe demais. Dadas essas circunstâncias, a transecção da aorta entre a artéria carótida comum esquerda (como a linha verde na Figura 2) para garantir que a aorta seja longa o suficiente e possa ser cânulada e ligada na aorta ascendente é melhor no passo 3.3. Considerando que a transecção na aorta ascendente, o comprimento reservado para a cannulação pelo menos poderia fixar a ponta da cânula perto da raiz aórtica e não penetrará nas válvulas aórticas após a ligadura. A anatomia da aorta e a medição da distância da ponta da cânula até o ostium ca indicam que a transecção da aorta entre a artéria carótida comum esquerda é uma posição ideal para alcançar uma profundidade adequada de cannulação de aorta.

A profundidade de cannulação foi encontrada associada à perfusão da átrida, que por sua vez atua como um indicador de profundidade. A Figura 4 mostra que a perfusão de atria é boa quando a profundidade está na aorta ascendente, e ambos os apêndices atrial são inflados. No entanto, a perfusão de atria é insuficiente quando a profundidade está (ou se aproximando) da raiz aórtica e ambos os apêndices atrial são enrugados. A contagem total e viável de AM rendendo dos apêndices atrial inflados foi maior (Figura 8). Esses achados indicam que a profundidade da cannulação da aorta pode afetar a perfusão e digestão dos apendices atria e atrial de uma certa forma e finalmente afetar o rendimento e a qualidade do AM. O rendimento e a qualidade do AM foram inferidos para estarem associados à distribuição dos navios que fornecem o atria. O estudo de Fernández et ^al.23 demonstrou várias anomalias na origem e curso do CA do rato. Eles descobriram que as ostia dos CAs eram altamente variáveis e não estavam todas localizadas no seio aórtico. Alguns CAs podem se originar anômalamente de cima dos seios aórticos, chamados de ostium de decolagem alta. Alguns CAs podem se originar do mesmo seio aórtico, e o ostium do vaso átrio está próximo. A anatomia da aorta no presente estudo (Figura 10) também é consistente com a descoberta de Fernández. Esta pode ser a causa pela qual as tentativas de isolar a AM pelo método Langendorff não tiveram sucesso se a profundidade da cannulação não for apropriada. Assim, a ponta da cânula terá maior chance de bloquear o ostium do vaso átrio que é adjacente ao ostium CA se não houver espaço suficiente entre a ponta da cânula e o ostium CA. Em contraste, a perfusão e o rendimento celular do ventrículo dificilmente foram afetados, desde que as válvulas aórticas não fossem penetradas pela ponta da cânula. Isso provavelmente é porque os CAs que fornecem sangue para o ventrículo têm ostia maior e mais origens. Se um ostium foi ocluído pela cânula, a perfusão ventrículo pode ser compensada por outro CA ou pela circulação colateral, enquanto o vaso sanguíneo que abastece o átrio é bastante pequeno e não tem substituto. Assim, a influência da profundidade na cannulação da aorta é importante.

Outros fatores notáveis e problemas de solucionação no processo de digestão e armazenamento de células estão listados da seguinte forma. Primeiro, considere perfusar a solução oxigenada de Tyrode na etapa 4.1 para fazer o músculo contraír e bombear sangue residual se o sangue na ária não tiver sido retirado após a ligadura da aorta. Isso pode ajudar a evitar o efeito adverso de ^ca2+ e outros materiais liberados dos eritrócitos danificados. Em segundo lugar, perfusar a solução ^ca2+-free com antecedência para dissociar a conexão e expandir o espaço entre as células pode melhorar a eficácia da digestão enzimática porque discos intercalados entre CMs são junções intercelulares dependentes de cálcio. No entanto, o tempo deve ser limitado a 3-5 min para evitar o fenômeno paradoxo do ^cálcio24. Recomenda-se uma solução enzimápica mista. A colagenase tipo II interrompe a rede de matriz extracelular, e a trippsina ajuda a limpar o material granular que permanece na superfície da célula se a digestão da colagemnase II estiver incompleta. Isso garante uma superfície celular lisa, que é fundamental para formar uma vedação GΩ na gravação do grampo de remendo. No entanto, a concentração de trippsina deve ser controlada na faixa adequada para evitar sobre digestão e lesões celulares, pois pode degradar a proteína da membrana. O uso do tipo 2 de colagenase sozinho para melhorar o rendimento celular pode muitas vezes levar à digestão do tecido, e os CMs isolados serão intolerantes ao cálcio após exposição prolongada à ^{colagemnase25}. O uso de monoxime de 2,3 butanedione (BDM), substância que previne a contração espontânea inibindo a mosina ATPase e prevenindo a formação de pontes cruzadas, ainda é controverso26,27,28,29. De acordo com a experiência anterior, a adição de BDM é necessária para este protocolo. A solução enzimápica é preparada com a solução 1, embora a solução 1 não contenha cálcio, e o cálcio é adicionado para ativar a enzima. O benefício da adição de BDM na solução de perfusão inclui (1) inibir a contração dos miócitos e reduzir o consumo de oxigênio durante a perfusão da solução enzimante e (2) prevenir miócitos de hipóxia e melhorar a qualidade dos miócitos isolados. Alguns estudos relataram que o BDM pode ter uma influência adversa potencial nas propriedades elétricas celulares. No entanto, os resultados do registro do grampo de remendo de células inteiras da corrente de sódio não indicaram um efeito indesejável. Na etapa de armazenamento celular (etapa 6), inúmeros estudos escolheram o tampão KB, uma solução de concentração de potássio livre de cálcio, mas alta, na qual as células podem manter um estado melhor porque estão em condições metabólicas polarizadas e baixas. No entanto, o gllicocalyx da membrana celular se separará da bicamada lipídica na ausência de cálcio exógeno por um determinado período de tempo e a permeabilidade da membrana aumentará, afetando a análise funcional subsequente30,31,32.

Todas as técnicas de isolamento de miócitos podem ser essencialmente categorizadas atualmente em uma digestão de um pedaço (um pequeno pedaço de tecido) em uma solução enzimática ou perfusão de CA com solução enzimática (a perfusão langendorff)²². Comparado com o método Langendorff, o método de digestão de pedaços é mais fácil de executar e também é usado rotineiramente para isolar CMs em muitos laboratórios. No entanto, este método normalmente produz um baixo rendimento de CMs de má qualidade a partir de tecidos ^adultos22. Além disso, as células isoladas por este método podem não ser adequadas para a realização de experimentos comparativos. Por exemplo, ao testar os efeitos de drogas específicas do tipo celular entre AM e VM, o impacto de diferentes condições de isolamento não pode ser negligenciado ou excluído. Isso porque o miocárdio e a densidade tecidual do ventrículo são muito mais espessos e mais densos que os do átrio, resultando em diferentes tempos de digestão e concentrações enzimáticas. Além disso, a agitação excessiva e a tubulação do tecido durante a digestão danificarão as células e impactarão significativamente os estudos funcionais. Além disso, muitos estudos anteriores mostraram que as AMs são mais vulneráveis ao cálcio. No entanto, as AMs isoladas pelo protocolo atual podem ser tolerantes à reintrodução gradiente de cálcio provavelmente porque o tecido é fácil de romper no final do processo de digestão. Assim, o dano mecânico é menor, enquanto as células sofreriam mais danos mecânicos, pois as etapas do método do pedaço precisam de ruptura repetida e centrífuga. Mais recentemente, Ackers et ^al.33 relataram um método simplificado, livre de Langendorff para o isolamento de miócitos cardíacos viáveis e não-miócitos. Os VMs e os fibroblastos podem ser efetivamente isolados, mas a quantidade de AMs não foi mencionada. No entanto, este protocolo tem várias limitações. Em primeiro lugar, a distribuição dos vasos sanguíneos cardíacos pode ter variações para diferenças individuais e cepa de camundongos, e a profundidade de cannulação recomendada não pode garantir um isolamento bem sucedido de AMs para cada vez. Em segundo lugar, para aqueles que são novos nesse procedimento pode levar um certo tempo para praticar a transção aorta e a canulação de aorta retrógrada. Finalmente, este método não foi testado em outros modelos de doenças cardíacas, exceto em camundongos saudáveis e idosos. Assim, exigirá ajustes nas concentrações enzimáticas e tempo de digestão devido à extensão da fibrose do coração. A desvantagem das diferentes condições de digestão encontradas no método do pedaço não será um problema no método Langendorff no qual a solução enzimácida é distribuída uniformemente ao tecido pelos leitos dos vasos.

Em resumo, os protocolos para o isolamento simultâneo de am único e VM descrito aqui demonstraram que a profundidade adequada da aorta cannulation pode efetivamente melhorar a perfusão do átrio e o rendimento am. Os CMs isolados por este método são de alta qualidade, possuem boa tolerância ao cálcio, e têm sido aplicados com sucesso no registro de grampos de remendo e manuseio de cálcio (liberação ^Ca2+ e medição de ondas ^Ca2+ pelo sistema IonOptix) na ^equipe34. Prevê-se que o protocolo de isolamento possa ser utilizado para preparação celular em uma série de investigações celulares e subcelulares, o que ajudará a aprofundar a compreensão da fisiologia cardíaca e da patologia. É importante ressaltar que permitirá a descoberta de mecanismos de doenças cardíacas mais clinicamente relevantes e métodos de intervenção.