Модификации метода Лангендорфа для одновременного выделения предсердных и желудочковых миоцитов у взрослых мышей

Одиночный КМ является ценным и незаменимым инструментом в исследованиях сердечной функции и заболеваний на клеточном ^{уровне20}. Следовательно, изоляция жизнеспособных КМ от сердец является начальным и наиболее важным шагом. Качество клеток является одним из существенных факторов, определяющих проведение успешных экспериментов, особенно в оптических и электрофизиологических экспериментах. По сравнению с КМ других животных, КМ грызунов более уязвимы к ишемии и гипоксии из-за более высокой концентрации внутриклеточных ионов натрия, что способствует притоку кальция через обменник Na⁺/^Ca2+21. Более того, количество АМ намного меньше, чем у виртуальных машин; таким образом, успешной изоляции чрезвычайно трудно достичь. Метод Лангендорфа отлично подходит для изоляции виртуальных машин на ^мышах22, но уровень успеха в изоляции AM низок, и доступно мало отчетов. Надлежащая глубина канюляции аорты также является важным фактором в получении идеальных виртуальных машин, помимо температуры, активности ферментов, рН и качества воды, используемой для подготовки буфера. Принцип метода Лангендорфа опирается на ретроградную перфузию сердца. При перфузии аортальный клапан закрывается; таким образом, перфусат проталкивается в коронарные артерии, доставляя раствор фермента через ветви сосудов, и ткань миокарда равномерно переваривается. Чтобы достичь такого рода циркуляции, аорта должна резервировать достаточную длину для канюляции и перевязки, также кончик канюли не должен проникать в аортальные клапаны или блокировать CA ostium. Таким образом, разумно предположить, что глубина канюляции аорты также связана с перфузией предсердий, которая аналогичным образом влияет на эффективность пищеварения предсердий и выход АМ. Протокол, представленный здесь, подтвердил гипотезу, и важные шаги для оптимизации выхода клеток вместе с предложениями отмечены ниже.

На этапе 1.9, чтобы лучше закрепить аорту, рекомендуется тупая канюля 20 G с выемкой (или окружной канавкой), откуда расстояние составляет 1 мм до кончика. Основываясь на нашем опыте, было обнаружено, что размер канюли, который немного больше диаметра аорты, предотвращает прокалывание кончиком канюли аортальных клапанов во время канюляции, потому что аорта, полагаясь на свою внутреннюю эластичность, может плотно вписываться в канюлю и производить трение, которое действует как защитный фактор при движении вперед или назад, регулируя глубину канюляции. С точки зрения положения выемки, сердце будет легко соскальзывать во время канюляции из-за гравитации, если оно находится слишком близко к кончику канюли. И наоборот, пространство для регулировки глубины канюляции и положения перевязки будет очень ограничено, хотя и слишком далеко. Учитывая эти обстоятельства, транссекция аорты между левой общей сонной артерией (как зеленая линия на рисунке 2) для обеспечения того, чтобы аорта была достаточно длинной и могла быть канюлирована и перевязана на восходящей аорте, лучше на шаге 3.3. В то время как трансекция на восходящей аорте, зарезервированная длина для канюляции, по крайней мере, может закрепить кончик канюли близко к корню аорты и не проникнет в аортальные клапаны после перевязки. Анатомия аорты и измерение расстояния от кончика канюли до остиума СА указывают на то, что транссекция аорты между левой общей сонной артерией является идеальным положением для достижения правильной глубины канюляции аорты.

Было обнаружено, что глубина каннуляции связана с перфузией предсердий, которая, в свою очередь, действует как индикатор глубины. На рисунке 4 показано, что перфузия предсердий хороша, когда глубина находится на восходящей аорте, а оба предсердных придатка раздуты. Однако перфузия предсердий недостаточна, когда глубина находится у корня аорты (или приближается к нему), и оба предсердных придатка увядшие. Общее и жизнеспособное количество АМ, полученное от раздутых предсердных придатков, было выше (рисунок 8). Эти результаты показывают, что глубина канюляции аорты может определенным образом влиять на перфузию и пищеварение предсердий и придатков предсердий и, наконец, влиять на урожайность и качество АМ. Было выведено, что выход и качество AM связаны с распределением сосудов, которые снабжают предсердия. Исследование Fernández et ^al.23 продемонстрировало различные аномалии в происхождении и течении СА мыши. Они обнаружили, что остии CA были очень изменчивыми и не все были расположены в пазухе аорты. Некоторые СА могут возникать аномально сверху пазух аорты, называемые остиумом высокого взлета. Некоторые СА могут происходить из одного и того же аортального синуса, а остиум сосуда предсердия находится совсем рядом. Анатомия аорты в настоящем исследовании (рисунок 10) также согласуется с открытием Фернандеса. Это может быть причиной того, что попытки изолировать AM методом Лангендорфа были в значительной степени безуспешными, если глубина канюляции не подходит. Таким образом, кончик канюли будет иметь больше шансов заблокировать остиум сосуда предсердий, который примыкает к остию СА, если между кончиком канюли и остиумом СА недостаточно места. Напротив, перфузия и выход клеток желудочка практически не были затронуты, пока аортальные клапаны не были пробиты кончиком канюли. Вероятно, это связано с тем, что СА, которые снабжают кровью желудочек, имеют большую остию и большее происхождение. Если один остиум был закупорен канюлей, перфузия желудочка может быть компенсирована другим СА или коллатеральным кровообращением, тогда как кровеносный сосуд, который снабжает предсердие, довольно мал и не имеет замены. Таким образом, влияние глубины на канюляцию аорты имеет важное значение.

Другие примечательные факторы и устранение неполадок в процессе пищеварения и хранения клеток перечислены ниже. Во-первых, рассмотрите возможность перфузии насыщенного кислородом раствора Тирода на этапе 4.1, чтобы заставить мышцу сокращаться и откачивать остаточную кровь, если кровь в предсердиях не была выброшена после перевязки аорты. Это может помочь избежать неблагоприятного воздействия ^ca2+ и других материалов, высвобождаемых из поврежденных эритроцитов. Во-вторых, перфузия ^ca2+ свободного раствора раньше времени для диссоциации связи и расширения пространства между клетками может повысить эффективность переваривания ферментов, поскольку интеркалированные диски между КМ являются кальциезависимыми межклеточными соединениями. Однако время должно быть ограничено 3-5 мин, чтобы избежать явления парадокса кальция24. Рекомендуется смешанный раствор ферментов. Коллагеназа типа II нарушает сеть внеклеточного матрикса, а трипсин помогает очистить гранулированный материал, который остается на поверхности клетки, если переваривание коллагеназы II неполное. Это обеспечивает гладкую поверхность ячейки, что имеет решающее значение для формирования уплотнения GΩ в записи патч-зажима. Тем не менее, концентрация трипсина должна контролироваться в надлежащем диапазоне, чтобы избежать чрезмерного пищеварения и повреждения клеток, потому что это может ухудшить мембранный белок. Использование только коллагеназы типа II для улучшения выхода клеток часто может привести к перевариванию тканей, а изолированные СМ будут непереносимыми кальцием после длительного воздействия коллагеназы25. Использование монооксима 2,3-бутандиона (BDM), вещества, которое предотвращает спонтанное сокращение путем ингибирования АТФазы миозина и предотвращения образования поперечных мостов26,27,28,29. Согласно предыдущему опыту, добавление BDM необходимо для этого протокола. Ферментный раствор готовят с раствором 1, хотя раствор 1 не содержит кальция, и кальций добавляют для активации фермента. Преимущество добавления БДМ в перфузионный раствор включает (1) ингибирование сокращения миоцитов и снижение потребления кислорода во время перфузии ферментного раствора и (2) предотвращение гипоксии миоцитов и улучшение качества выделенных миоцитов. В некоторых исследованиях сообщалось, что BDM может оказывать потенциальное неблагоприятное влияние на электрические свойства клеток. Однако результаты регистрации тока натрия цельноклеточным пластырем не указывали на нежелательный эффект. На этапе хранения клеток (этап 6) многочисленные исследования выбрали буфер KB, раствор без кальция, но с высокой концентрацией калия, в котором клетки могут поддерживать лучшее состояние, потому что они находятся в поляризованных и низких метаболических условиях. Однако гликокаликс клеточной мембраны будет отделяться от липидного бислоя при отсутствии экзогенного кальция в течение определенного промежутка времени и проницаемость мембраны будет увеличиваться, влияя на последующий функциональный анализ30,31,32.

Все методы выделения миоцитов в настоящее время могут быть по существу классифицированы либо как кусок (небольшой кусочек ткани) пищеварения в ферментативном растворе, либо перфузия СА с ферментативным раствором (перфузия Лангендорфа)²². По сравнению с методом Лангендорфа, метод сбраживания кусков легче выполнять, а также обычно используется для выделения КМ во многих лабораториях. Однако этот метод обычно дает низкий выход КМ низкого качества из взрослых ^{тканей22}. Более того, клетки, выделенные этим методом, могут не подходить для проведения сравнительных экспериментов. Например, при тестировании специфических для клеточных типов лекарственных эффектов между АМ и ВМ нельзя пренебрегать или исключать воздействие различных условий изоляции. Это связано с тем, что миокард и плотность тканей желудочка намного толще и плотнее, чем у предсердий, что приводит к различному времени переваривания и концентрации ферментов. Кроме того, чрезмерное перемешивание и пипетирование ткани во время пищеварения повредят клетки и значительно повлияют на функциональные исследования. Более того, многие предыдущие исследования показали, что ПМ более уязвимы к кальцию. Тем не менее, АМ, выделенные текущим протоколом, могут быть терпимы к градиентному реинтродукции кальция, вероятно, потому, что ткань легко разрывается в конце процесса пищеварения. Таким образом, механическое повреждение меньше, тогда как клетки будут страдать от большего количества механических повреждений, поскольку этапы метода куска нуждаются в повторном разрыве и центробежном. Совсем недавно Ackers et ^al.33 сообщили об упрощенном, свободном от Лангендорфа методе выделения жизнеспособных сердечных миоцитов и немиоцитов. Виртуальные машины и фибробласты могут быть эффективно изолированы, но количество АМ не упоминалось. Однако этот протокол имеет ряд ограничений. Во-первых, распределение кровеносных сосудов сердца может иметь вариации для индивидуальных различий и штамма мышей, а рекомендуемая глубина канюляции не может гарантировать успешную изоляцию ПМ для каждого раза. Во-вторых, для тех, кто новичок в этой процедуре, может потребоваться определенное количество времени, чтобы практиковать трансекцию аорты и ретроградную канюляцию аорты. Наконец, этот метод не был протестирован на других моделях сердечных заболеваний, за исключением здоровых и пожилых мышей. Следовательно, это потребует корректировки концентрации ферментов и времени пищеварения из-за степени фиброза сердца. Недостаток различных условий пищеварения, встречающихся в кусковом методе, не будет проблемой в методе Лангендорфа, в котором раствор фермента равномерно распределяется по тканям по слоям сосудов.

Таким образом, протоколы одновременной изоляции одного AM и VM, описанные здесь, продемонстрировали, что правильная глубина канюляции аорты может эффективно улучшить перфузию предсердий и выход AM. CM, выделенные этим методом, имеют высокое качество, обладают хорошей толерантностью к кальцию и успешно применяются для записи зажимов и обработки кальция (высвобождение ^{Ca2 +} и измерение волны ^{Ca2 +} системой IonOptix) в ^{команде34}. Предполагается, что протокол изоляции может быть использован для подготовки клеток в серии клеточных и субклеточных исследований, что поможет углубить понимание физиологии и патологии сердца. Важно отметить, что это позволит обнаружить более клинически значимые механизмы сердечных заболеваний и методы вмешательства.