פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.
קרדיומיוציט יחיד הוא כלי חיוני במחקרים ברמה התאית והתת-תאית של ביולוגיה לבבית ומחלות כיחידה בסיסית של התכווצות ופעילות חשמלית. לפיכך, בידוד קרדיומיוציטים קיימא ואיכותיים מהלב הוא הצעד הניסיוני הראשוני והמכריע ביותר. השוואת הפרוטוקולים השונים לבידוד הקרדיומיוציטים של עכברים בוגרים, זלוף מדרדר לנגנדורף הוא השיטה המוצלחת ביותר לשחזור המדווחת בספרות, במיוחד לבידוד מיוציטים חדריים. עם זאת, בידוד מיוציטים פרוזדורים איכותיים מהלב המנוזל נותר מאתגר, ומעט דיווחי בידוד מוצלחים זמינים. פתרון בעיה מסובכת זו חשוב ביותר כי מלבד מחלת חדרית, מחלת פרזדורים מהווה חלק גדול של מחלות לב. לכן, חקירות נוספות ברמה התאית כדי לחשוף את המנגנונים מוצדקות. במאמר זה, פרוטוקול המבוסס על שיטת זלוף מדרדר Langendorff הוא הציג כמה שינויים בעומק של שימור אבי העורקים ואת הצעדים שעשויים להשפיע על תהליך העיכול כדי לבודד מיוציטים פרוזדורים חדריים נעשו בו זמנית. יתר על כן, קרדיומיוציטים מבודדים מאושרים להיות מקובל כדי תיקון מהדק חקירה.
מחלת לב היא אחד הגורמים המובילים בעולם לתמותה1. כדי להתמודד עם נטל זה על מערכת הבריאות, נדרשת הבנה מעמיקה של הפיזיולוגיה והפתולוגיה של הלב. מלבד הכנה מלאה של בעלי חיים ולב שלם, הכנה תאית היא כלי חיוני נוסף לחקר תפקוד ומחלות2. על ידי יישום מהדק התיקון, הדמיית סידן, ביולוגיה מולקולרית וטכנולוגיות מתקדמות אחרות, החוקרים יכולים לקבל מידע נוסף על התכונות האלקטרופיזיולוגיות, הומאוסטזיס סידן, מסלולי איתות, מצבים מטבוליים, ותעתיק גנים בקרדיומיוציטים יחיד (CM). זה עוזר מאוד לחשוף את המנגנונים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של תהליך מחלות הלב3,4,5,6,7. לחקר בעלי חיים, ניתן להשתמש במינים קטנים (למשל, עכברים, חולדות ושפני ניסיונות) ועד בעלי חיים גדולים (למשל ארנבים וכלבים). בעלי חיים קטנים מועדפים בדרך כלל, במיוחד עכברים, משום שהם מקובלים על מניפולציה גנטית ומודל מחלות8,9,10.
טכניקות של CMs מבודדים בחריפות עברו תקופת פיתוח ארוכה ועדיין מתפתחות11. זלוף מדרדר לנגנדורף הוא שיטת הבידוד המצליחה ביותר שניתן לשחזר בה המיושמת בחולדות ועכברים, במיוחד לבידוד מיוציטים חדריים (VMs)12,13,14,15. עם זאת, דיווחים על מיוציטים מפרזדורים מבודדים בהצלחה (AMs) הם נדירים16,17,18. חקירות נוספות בשתי הרמות של האיברים/מערכת כולה והתת-תאיים כדי לחשוף את המנגנונים ולחקור גישות טיפוליות חדשות מוצדקות מכיוון שפרפור פרוזדורים (AF), הסוג הנפוץ ביותר של הפרעות קצב, הופך יותר ויותר נפוץ ברחבי העולם, ומודלים הטיפול הנוכחיים הן בטיפולים פרמקולוגיים והן בבלציה לבבית נשארים לא יעילים בכ -40%-50% מחולי AF19 . בידוד מוצלח של עכבר למבוגרים הוא הצעד הראשון למחקר סלולרי. ניתן להשתמש בשתי שיטות בידוד עיקריות: הנתח ושיטות לנגנדורף. בשיטת זלוף לנגנדורף, עיכול רקמות תלוי בתמיסת האנזים המועברת על ידי העורקים הכליליים וענפיהם למיטות נימיות. עומק שימורי אבי העורקים הנכון שיכול להימנע מחדירה של שסתומי אבי העורקים וחסימת אוסטיה העורק הכלילי הוא תנאי מוקדם להשגת דפוס זלוף כזה, שהוא גם הצעד החיוני לעיכול יעיל ותפוקת VM אידיאלית. לפיכך, סביר להניח כי עומק שימורי העורקים עשוי להשפיע באופן דומה על זלוף כלי האטיה ולבסוף להשפיע על התשואה AM. כדי לבדוק השערה זו, שבוצעה קנוניציה של העורקים בעומקים שונים והשוו את תשואות AM המתאימות. הנתונים הראו כי עומק שימורי העורקים רלוונטי ישירות לתפוקת AM. להלן, פרוטוקול לבידוד AMs ו- VMs מוצג בו זמנית.
CM יחיד הוא כלי בעל ערך וחיוני במחקרי רמת התאים של תפקוד הלב ומחלות20. לפיכך, הבידוד של CMs קיימא מהלבבות הוא הצעד הראשוני והמכריע ביותר. איכות התא היא אחד הגורמים המשמעותיים לעריכת ניסויים מוצלחים, במיוחד בניסויים אופטיים ואלקטרופיזיולוגיים. בהשוואה ל- CMs של בעלי חיים אחרים, CMs מכרסמים פגיעים יותר לאיסכמיה והיפוקסיה בגלל ריכוז גבוה יותר של יוני נתרן תאיים, אשר מעדיף זרם סידן באמצעות Na +/Ca2+ מחליף21. יתר על כן, מספר AMs הוא הרבה פחות מזה של VMs; לכן, בידוד מוצלח קשה מאוד להשגה. שיטת לנגנדורף מצוינת לבידוד עכברים VMs22, אך שיעור ההצלחה בבידוד AMs נמוך, ודיווחים מעטים זמינים. העומק הנכון של שימורי העורקים הוא גם גורם חיוני בהניב סוגי אידיאליים מלבד טמפרטורה, פעילות אנזימים, PH ואיכות מים המשמשים להכנת חיץ. העיקרון של שיטת לנגנדורף מסתמך על זלוף מדרדר של הלב. עם זלוף, שסתום אבי העורקים סגור; ובכך, זלוף נאלץ לתוך העורקים הכליליים, מתן פתרון אנזימים דרך ענפי הכלי, ואת רקמת שריר הלב מתעכל באופן שווה. כדי להשיג סוג זה של דפוס מחזור, אבי העורקים חייב לשמור מספיק אורך עבור cannulation ו קשירה, גם קצה הקנולה לא חייב לחדור את שסתומי אבי העורקים או לחסום את ostium CA. לכן, סביר לשער כי עומק cannulation אב העורקים קשור גם עם זלוף אטריה, אשר משפיע על יעילות העיכול של atria ואת התשואות של AM באופן דומה. הפרוטוקול המוצג כאן אישר את ההשערה, וצעדים חיוניים למיטוב תפוקת התא יחד עם ההצעות נרשמים להלן.
בשלב 1.9, כדי לאבטח טוב יותר את ביש”ט, צינורית קהה 20 G עם חריץ (או חריץ היקפי) מהמקום שבו המרחק הוא 1 מ”מ לקצה מומלץ. בהתבסס על החוויות שלנו, גודל הצינורית כי הוא קצת יותר גדול מאשר הקוטר של אבי העורקים נמצא כדי למנוע את קצה הצינורית מלנקב את שסתומי אבי העורקים במהלך cannulation כי אבי העורקים, המסתמך על האלסטיות המהותית שלה, יכול להתאים באופן נוח לתוך הצינורית ולייצר חיכוך, אשר משמש כגורם מגן בעת נע קדימה או אחורה התאמת עומק הצינור. במונחים של המיקום של החרץ, הלב יחליק בקלות במהלך cannulation בגלל כוח המשיכה אם הוא קרוב מדי קצה הצינורית. לעומת זאת, המרחב להתאמת עומק הקנולציה ותנוחת הקשירה יהיה מוגבל מאוד אם רחוק מדי. בהתחשב בנסיבות אלה, חלוקת צינור העורקים בין עורק העורק הראשי המשותף השמאלי (כקו הירוק באיור 2) כדי להבטיח שאור העורקים ארוך מספיק וניתן יהיה לקשירה ולקשירה בבוטה העורקים העולה עדיף בשלב 3.3. בעוד טרנסג’נקט ב אבי העורקים העולה, האורך השמור לצמחייה לפחות יכול לאבטח את קצה הצינורית קרוב לשורש אבי העורקים ולא יחדור את שסתומי אבי העורקים לאחר קשירה. האנטומיה של aorta ואת מדידת המרחק מקצה הצינורית לאוסטיום CA מצביעים על כך שחלוקת צינור העורקים בין עורק העורק הראשי המשותף השמאלי היא מיקום אידיאלי להשגת עומק צינוריות נאות.
עומק הקנוניציה נמצא קשור לחדירה של האטריה, אשר בתורו משמש אינדיקטור עומק. איור 4 מראה שחדירת אטריה טובה כאשר העומק נמצא באפהעורקים העולה, ושני נספחי האיתור מנופחים. עם זאת, זלוף אטריה אינו מספיק כאשר העומק הוא (או מתקרב) השורש בים העורקים ושני נספחי פרוזדורים הם wizened. הספירה הכוללת והקיימה של AM שהונפקו מנספחי האיתור המנופחים הייתה גבוהה יותר (איור 8). ממצאים אלה מצביעים על כך שעומק שימורי העורקים יכול להשפיע על זלוף ועיכול של אטריה ונספחי פרוזדורים בצורה מסוימת ולבסוף להשפיע על התשואה והאיכות של AM. התשואה והאיכות של AM היו להסיק להיות קשור עם הפצת כלי המספקים את atria. המחקר של פרננדז ואח ’23 הראה אנומליות שונות במקור ומהלך של עכבר CA. הם מצאו כי אוסטיה CAs היו משתנים מאוד ולא היו כולם ממוקמים בסינוס בים העורקים. חלק מה-CAs עשויים לנבוע באופן חריג מעל הסינוסים של בים העורקים, הנקראים אוסטיום ההמראה הגבוה. חלק מה-CAs עשויים לנבוע מאותו סינוס בים העורקים, והאוסטיום של כלי האטריום נמצא ממש בקרבת מקום. האנטומיה של אבי העורקים במחקר הנוכחי (איור 10) עולה בקנה אחד גם עם מציאתו של פרננדז. זו עשויה להיות הסיבה מדוע ניסיונות לבודד AM על ידי שיטת Langendorff לא הצליחו במידה רבה אם עומק cannulation אינו מתאים. לכן, קצה הצינורית יהיה סיכוי גדול יותר של חסימת אוסטיום כלי אטריום כי הוא סמוך אוסטיום CA אם אין מספיק מקום זמין בין קצה הצינורית אוסטיום CA. לעומת זאת, זלוף ותפוקת התא של החדר בקושי הושפעו כל עוד שסתומי אבי העורקים לא חדרו על ידי קצה הצינורית. הסיבה לכך היא כנראה כי CAs המספקים דם לחדר יש אוסטיה גדולה יותר ומקורות נוספים. אם אוסטיום אחד נחסם על ידי הצינורית, זלוף חדרים יכול להיות פיצוי על ידי CA אחר או מחזור המשנה, ואילו כלי הדם המספק את האטריום הוא קטן למדי ואין לו תחליף. לכן, ההשפעה של העומק ב cannulation aorta חשוב.
גורמים ראויים לציון אחרים וירי צרות בתהליך העיכול ואחסון התא מפורטים כדלקמן. ראשית, שקול לזילוף הפתרון של טיירוד מחומצן בשלב 4.1 כדי להפוך את השריר להתכווץ ולשאוב את הדם שיורית אם הדם באטריה לא הובהל החוצה לאחר קשירת כאבי העורקים. זה יכול לעזור למנוע את ההשפעה השלילית של ca2+ וחומרים אחרים ששוחררו אריתרוציטים פגום. שנית, זלוף תמיסה ca2 + חינם מראש כדי לנתק את החיבור ולהרחיב את המרחב בין תאים יכול לשפר את היעילות של עיכול אנזימים כי דיסקים intercalated בין CMs הם צמתים בין תאיים תלויי סידן. עם זאת, יש להגביל את הזמן ל 3-5 דקות כדי למנוע את תופעת פרדוקס סידן24. מומלץ תפתרון אנזימים מעורב. קולגנאז סוג II משבש את רשת המטריצה החוץ-תאית, ותפסין מסייע לנקות את החומר הגרגרי שנותר על פני התא אם העיכול של קולגנאז II אינו שלם. זה מבטיח משטח תא חלק, שהוא קריטי ליצירת חותם GΩ בהקלטת מהדק התיקון. עם זאת, ריכוז טריפסין צריך להיות נשלט בטווח הנכון כדי למנוע עיכול יתר ופגיעה בתא כי זה יכול לבזות את חלבון הממברנה. שימוש בקולגנאז מסוג II בלבד כדי לשפר את תפוקת התאים עלול להוביל לעתים קרובות לרקמות על פני העיכול, וה- CMs המבודדים יהיו עמידים לסידן לאחר חשיפה ממושכת לקולגן25. השימוש במונוקסימה 2,3-butanedione (BDM), חומר המונע התכווצות ספונטנית על ידי עיכוב ATPase המיוסין ומניעת היווצרות גשר חוצה, עדיין שנוי במחלוקת26,27,28,29. על פי ניסיון קודם, הוספת BDM נחוצה לפרוטוקול זה. תמיסה אנזימים מוכנה עם פתרון 1 למרות תמיסה 1 אינו מכיל סידן, סידן מתווסף כדי להפעיל את האנזים. היתרון של הוספת BDM בתמיסת זלוף כולל (1) עיכוב התכווצות מיוציטים והפחתת צריכת חמצן במהלך זלוף פתרון אנזימים ו -(2) מניעת מיוציטים מהיפוקסיה ושיפור איכות המיוציטים המבודדים. מספר מחקרים דיווחו כי BDM עשויה להיות השפעה שלילית פוטנציאלית על תכונות חשמליות הסלולר. עם זאת, התוצאות של הקלטת מהדק תיקון התא כולו של זרם הנתרן לא הצביעו על השפעה בלתי רצויה. בשלב אחסון התאים (שלב 6), מחקרים רבים בחרו את מאגר KB, פתרון ללא סידן אך ריכוז אשלגן גבוה, שבו תאים יכולים לשמור על מצב טוב יותר מכיוון שהם נמצאים במצבים מקוטבים ומטבוליים נמוכים. עם זאת, הגליקוקליקס של קרום התא ייפרד מביל השומנים בהיעדר סידן אקסוגני לפרק זמן מסוים וחדירות הממברנה תגדל, ותשפיע על הניתוח התפקודי הבא30,31,32.
כל טכניקות הבידוד myocytes ניתן לסווג כיום לתוך כל נתח (חתיכה קטנה של רקמה) עיכול בתמיסה אנזימטית או זלוף CA עם פתרון אנזימטי (זלוף Langendorff)22. בהשוואה לשיטת לנגנדורף, שיטת העיכול של הנתח קלה יותר לביצוע ומשמשת גם באופן שגרתי לבידוד CMs במעבדות רבות. עם זאת, שיטה זו מייצרת בדרך כלל תשואה נמוכה של CMs באיכות ירודה מרקמות מבוגרות22. יתר על כן, תאים מבודדים בשיטה זו עשויים שלא להתאים לעריכת ניסויים השוואתיים. לדוגמה, בעת בדיקת השפעות סמים ספציפיות לסוג התא בין AM ו- VM, לא ניתן להזניח או לא לכלול את ההשפעה של תנאי בידוד שונים. הסיבה לכך היא שריר הלב וצפיפות הרקמות של החדר הם הרבה יותר עבה וצפוף מזה של האטריום, וכתוצאה מכך זמני עיכול שונים וריכוזים אנזימים. יתר על כן, תסיסה מוגזמת וצינורות של הרקמה במהלך העיכול יפגעו בתאים וישפיעו באופן משמעותי על מחקרים פונקציונליים. יתר על כן, מחקרים קודמים רבים הראו כי AMs פגיעים יותר לסידן. עם זאת, AMs מבודד על ידי הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות סובלני של סידן הדרגתי reintroduction כנראה בגלל הרקמה קלה לקרע בסוף תהליך העיכול. לכן, נזק מכני הוא פחות, בעוד תאים יסבלו יותר נזקים מכניים כמו צעדים של שיטת נתח צריך קרע חוזר וצנטריפוגלי. לאחרונה, Ackers et al.33 דיווחו על שיטה פשוטה, ללא לנגנדורף לבידוד של מיוציטים לב קיימא nonmyocytes. ניתן לבודד ביעילות את ה- VMs ואת הפיברובלסטים, אך כמות ה- AMs לא הוזכרה. עם זאת, לפרוטוקול זה יש מספר מגבלות. ראשית, התפלגות כלי הדם של הלב עשויה להיות וריאציות עבור הבדלים בודדים ומתח עכברים, ואת עומק cannulation המומלץ לא יכול להבטיח בידוד AMs מוצלח עבור כל פעם. שנית, עבור אלה חדשים בהליך זה עשוי לקחת כמות מסוימת של זמן כדי לתרגל טרנספרציה של אב העורקים ו cannulation אב העורקים מדרדר. לבסוף, שיטה זו לא נבדקה במודלים אחרים של מחלות לב אלא בעכברים בריאים וקשישים. לפיכך, זה ידרוש התאמות בריכוזים אנזימים וזמן העיכול בגלל היקף פיברוזיס של הלב. החיסרון של תנאי עיכול שונים שנתקלו בשיטת הנתח לא יהיה בעיה בשיטת לנגנדורף שבה תמיסת האנזים מופצת באופן שווה לרקמה על ידי מיטות כלי הדם.
לסיכום, הפרוטוקולים לבידוד בו זמנית של AM יחיד ו- VM המתוארים כאן הוכיחו כי עומק שימורי העורקים הנכון יכול לשפר ביעילות זלוף אטריום ותפוקת AM. ה- CMs המבודדים בשיטה זו הם באיכות גבוהה, בעלי עמידות טובה לסידן, והם הוחלו בהצלחה על הקלטת מהדק תיקון וטיפול בסידן (שחרור Ca2+ ומדידת גל Ca2+ על ידי מערכת IonOptix) בצוות34. צפוי כי פרוטוקול הבידוד יכול לשמש להכנת התא בסדרה של חקירות תאיות ותת-תאיות, אשר יסייעו להעמיק את ההבנה של פיזיולוגיה לב ופתולוגיה. חשוב לציין, זה יאפשר גילוי של מנגנוני מחלות לב רלוונטיים יותר מבחינה קלינית ושיטות התערבות.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) והקרן למדעי הטבע של בייג’ינג (מס ‘7192051). תרומות מחברים: באי וליו עיצבו והרו את הפרויקט. וון ורואן סיפקו עצות חשובות לניסויים. וו ולילינג לי ביצעו את העבודה הניסיונית ומילאו תפקידי מפתח ברכישת נתונים, ניתוח ופרשנות. לי השתתף בהרכבת מנגנון לנגנדורף. פנג, ג’אנג, וואנג ויאנג השתתפו בהכנת ריאגנטים ופתרונות לפני הניסוי. וו כתב את המאמר.
2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
Excel | data acquisition and analysis | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
Water bath | JULABO | ED (v.2) |