Bu protokol, yetişkin farelerden atriyal ve ventrikül miyositlerinin eşzamanlı izolasyonu için aort kanülasyonunun derinliğini de içeren Langendorff yönteminin modifikasyonlarını açıklar.
Tek bir kardiyomiyosit, temel bir kasılma ve elektriksel aktivite birimi olarak kardiyak biyoloji ve hastalıkların hücresel ve hücre altı düzeydeki çalışmalarında hayati bir araçtır. Bu nedenle, kalpten uygulanabilir, yüksek kaliteli kardiyomiyositleri izole etmek ilk ve en önemli deneysel adımdır. Yetişkin farelerin kardiyomiyositlerini izole etmek için çeşitli protokolleri karşılaştıran Langendorff retrograd perfüzyon, literatürde bildirilen en başarılı ve tekrarlanabilir yöntemdir, özellikle ventrikül miyositlerini izole etmek için. Bununla birlikte, perfüzyonlu kalpten kaliteli atriyal miyositlerin izole edilmesi zor olmaya devam eder ve birkaç başarılı izolasyon raporu mevcuttur. Bu karmaşık sorunun çözümü son derece önemlidir, çünkü ventrikül hastalığı dışında, atriyal hastalık kalp hastalıklarının büyük bir kısmını oluşturur. Bu nedenle, mekanizmaları ortaya çıkarmak için hücresel düzeyde daha fazla araştırma yapılmasını garanti eder. Bu yazıda Langendorff retrograd perfüzyon yöntemine dayalı bir protokol getirilmiş ve aort kanülasyonu derinliğinde bazı değişiklikler ile atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için sindirim sürecini etkileyebilecek adımlar aynı anda yapılmıştır. Ayrıca, izole kardiyomiyositlerin kelepçe incelemesini düzeltmeye uygun olduğu doğrulanmaktadır.
Kardiyak hastalık mortalitenin önde gelen küresel nedenlerinden biridir1. Sağlık sistemi üzerindeki bu yükü gidermek için kalbin fizyolojisinin ve patolojisinin derinlemesine anlaşılması esastır. Tüm hayvan ve sağlam kalp hazırlığının yanı sıra, hücresel hazırlık fonksiyonel ve hastalık çalışması için bir başka vazgeçilmez araçtır2. Yama kelepçesi, kalsiyum görüntüleme, moleküler biyoloji ve diğer ileri teknolojileri uygulayarak, araştırmacılar tek bir kardiyomiyositte (CM) elektrofizyolojik özellikler, kalsiyum homeostaz, sinyal yolları, metabolik durumlar ve gen transkripsiyonları hakkında daha fazla bilgi edinebilirler. Bu, kardiyak hastalık sürecinin fizyolojik ve patolojik mekanizmalarını ortaya çıkarmada son derece yararlıdır3,4,5,6,7. Hayvan araştırmaları için, küçük (örneğin, fareler, sıçanlar ve kobaylar) büyük (örneğin, tavşanlar ve köpekler) hayvanlara kadar çeşitli türler kullanılabilir. Küçük hayvanlar genellikle tercih edilir, özellikle fareler, çünkü genetik ve hastalık modeli manipülasyonu8,9,10’a elverişlidirler.
Akut olarak izole edilmiş CD’lerin teknikleri uzun bir gelişim döneminden geçmiştir ve hala gelişmektedir11. Langendorff retrograd perfüzyonu, özellikle ventrikül miyositlerini (VM) izole etmek için sıçanlarda ve farelerde uygulanan en başarılı ve tekrarlanabilir CD izolasyon yöntemidir 12,13,14,15. Bununla birlikte, başarıyla izole edilmiş atriyal miyositlerin (AM) raporları azdır16,17,18. Mekanizmaları ortaya çıkarmak ve yeni terapötik yaklaşımları araştırmak için tüm organ /sistemin hem seviyeleri hem de hücresel/alt hücre üzerinde daha fazla araştırma garanti edilir, çünkü en yaygın aritmi türü olan atriyal fibrilasyon (AF) küresel olarak giderek yaygınlaşmaktadır ve af hastalarının yaklaşık% 40-50’sinde hem farmakolojik tedavilerde hem de kardiyak ablasyonda mevcut tedavi yöntemleri etkisiz kalmaktadır19 . Başarılı yetişkin fare CD’leri izolasyonu hücresel çalışma için ilk adımdır. İki birincil yalıtım yöntemi kullanılabilir: öbek ve Langendorff yöntemleri. Langendorff perfüzyon yönteminde doku sindirimi koroner arterler ve dalları tarafından kılcal yataklara teslim edilen enzim çözeltisine bağlıdır. Aort kapaklarına nüfuz etmeyi ve koroner arter ostiasını bloke etmeyi önleyebilecek uygun bir aort kanülasyon derinliği, verimli sindirim ve ideal VM verimi için de temel adım olan böyle bir perfüzyon desenine ulaşmanın ön koşuludur. Bu nedenle, aort kanülasyonunun derinliğinin atria gemisinin perfüzyonunu benzer şekilde etkileyebileceğini ve son olarak verimini etkileyebileceğini varsaymak mantıklıdır. Bu hipotezi test etmek için farklı derinliklerde aort kanülasyonu yapıldı ve buna karşılık gelen verimleri karşılaştırıldı. Veriler, aort cannülasyon derinliğinin verimi ile doğrudan ilişkili olduğunu gösterdi. Burada, AM’leri ve VM’leri aynı anda yalıtmak için bir protokol getirilmiştir.
Tek CM, kardiyak fonksiyon ve hastalıkların hücresel düzeydeki çalışmalarında değerli ve vazgeçilmez bir araçtır20. Bu nedenle, uygulanabilir CD’lerin kalplerden izolesi ilk ve en önemli adımdır. Hücre kalitesi, özellikle optik ve elektrofizyolojik deneylerde başarılı deneyler yapmanın önemli belirleyicilerinden biridir. Diğer hayvanların CD’leri ile karşılaştırıldığında, kemirgen CD’leri, Na+/ Ca2 + exchanger21 aracılığıyla kalsiyum akınını destekleyen daha yüksek hücre içi sodyum iyonları konsantrasyonu nedeniyle iskemi ve hipoksiye karşı daha savunmasızdır. Ayrıca, sayısı VM’lerden çok daha azdır; bu nedenle, başarılı izolasyon elde etmek son derece zordur. Langendorff yöntemi fare VM’lerini izole etmek için mükemmeldir22, ancak AM’leri izole etmedeki başarı oranı düşüktür ve çok az rapor mevcuttur. Aort cannülasyonunun uygun derinliği, tampon hazırlama için kullanılan sıcaklık, enzim aktivitesi, PH ve su kalitesi dışında ideal VM’lerin eldeılmasında da önemli bir faktördür. Langendorff yönteminin prensibi kalbin retrograd perfüzyona dayanır. Perfüzyon üzerine aort kapağı kapatılır; böylece perfüzyon koroner arterlere zorla sokarak damar dallarından enzim çözeltisi iletilir ve miyokard dokusu eşit olarak sindirilir. Bu tür bir dolaşım desenini elde etmek için, aort kanülasyon ve ligasyon için yeterli uzunluk ayırmalı, ayrıca kanül ucu aort kapaklarına nüfuz etmemeli veya CA ostiumunu engellememelidir. Bu nedenle, aort kanülasyonunun derinliğinin, atria’nın sindirim etkinliğini ve verimini benzer şekilde etkileyen atria perfüzyonu ile de ilişkili olduğunu tahmin etmek mantıklıdır. Burada sunulan protokol hipotezi doğruladı ve önerilerle birlikte hücre verimini optimize etmek için önemli adımlar aşağıda not edildi.
Adım 1.9’da, aortu daha iyi sabitlemek için, uçtaki mesafenin 1 mm olduğu yerden bir çentik (veya çevresel bir oluk) ile kör bir 20 G’lık bir kavun önerilir. Deneyimlerimize dayanarak, aortun çapından biraz daha büyük olan kanül boyutunun, kanül ucunun kanülasyon sırasında aort kapaklarını delmesini önlediği bulunmuştur, çünkü aort, içsel elastikiyetine güvenerek, kanüle sıkıca sığabilir ve kanülasyon derinliğini ayarlarken koruyucu bir faktör olarak işlev gören sürtünme üretebilir. Çentiğin konumu açısından, kalp, canül ucuna çok yakınsa yerçekimi nedeniyle canülasyon sırasında kolayca kayar. Tersine, cannülasyon derinliğini ve ligasyon pozisyonunu ayarlamak için alan çok uzaksa çok sınırlı olacaktır. Bu koşullar göz önüne alındığında, aortu yeterince uzun olduğundan ve yükselen aortta kanüle edilip lige edilebilmesini sağlamak için sol ortak karotid arter arasındaki aortu ( Şekil 2’deki yeşil çizgi olarak) transekte etmek 3.3. Yükselen aortta transeksiyon olurken, kanülasyon için ayrılmış uzunluk en azından kanül ucunu aort köküne yakın sabitleyebilir ve ligasyondan sonra aort kapaklarına nüfuz etmez. Aortu anatomisi ve kanül ucundan CA ostiumuna olan mesafenin ölçümü, aortu sol ortak karotid arter arasında transeksiyonun uygun bir aort kanülasyon derinliği elde etmek için ideal bir konum olduğunu göstermektedir.
Kanülasyon derinliğinin, atria perfüzyonu ile ilişkili olduğu bulunmuştur, bu da bir derinlik göstergesi görevi görür. Şekil 4 , derinlik yükselen aortta olduğunda atria perfüzyonun iyi olduğunu ve her iki atriyal ekin de şişirildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, derinlik aort kökündeyken (veya yaklaştığında) atria perfüzyonu yetersizdir ve her iki atriyal ek de wizened. Şişirilmiş atriyal eklerden elde edilen toplam ve uygulanabilir sayısı daha yüksekti (Şekil 8). Bu bulgular, aort kanülasyon derinliğinin atria ve atriyal eklerin perfüzyonunu ve sindirimini belirli bir şekilde etkileyebileceğini ve son olarak verimini ve kalitesini etkileyebileceğini göstermektedir. AM’nin verimi ve kalitesi, aryayı besleyen gemilerin dağılımı ile ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır. Fernández ve ark.23 çalışması, fare CA’sının kökeninde ve seyrinde çeşitli anomaliler göstermiştir. CA ostiasının oldukça değişken olduğunu ve hepsinin aort sinüsünde yer aldığını buldular. Bazı CA’lar, yüksek kalkışlı ostium olarak adlandırılan aort sinüslerinin üstünden anormal bir şekilde kaynaklanabilir. Bazı CA’lar aynı aort sinüsünden kaynaklanabilir ve atriyum kabının ostium’u hemen yakındadır. Bu çalışmadaki aortu anatomisi de Fernández’in bulunmasıyla tutarlıdır (Şekil 10). Bu, cannülasyon derinliği uygun değilse, AM’yi Langendorff yöntemiyle izole etme girişimlerinin büyük ölçüde başarısız olmasının nedeni olabilir. Bu nedenle, canül ucu ile CA ostium arasında yeterli alan yoksa, canül ucunun CA ostium’a bitişik olan atriyum damar ostiumunu engelleme şansı daha yüksek olacaktır. Buna karşılık, aort kapakları kanül ucu tarafından nüfuz edilmedikçe ventrikülün perfüzyonu ve hücre verimi neredeyse hiç etkilenmedi. Bunun nedeni muhtemelen ventriküle kan sağlayan CA’ların daha büyük ostia ve daha fazla kökene sahip olmasıdır. Bir ostium kanül tarafından tıkanmışsa, ventrikül perfüzyonu başka bir CA veya kollateral dolaşım ile telafi edilebilirken, atriyumu sağlayan kan damarı oldukça küçüktür ve yerini hiçbir şey tutamaz. Bu nedenle, aort cannülasyonundaki derinliğin etkisi önemlidir.
Sindirim ve hücre saklama sürecindeki diğer dikkat çekici faktörler ve sorun çekimleri aşağıdaki gibi sıralanmıştır. İlk olarak, aort ligasyonundan sonra atriadaki kan aceleye getirilmemişse, kas kasmasını sağlamak ve artık kan pompalamak için 4.1 adımda oksijenli Tyrode’un çözeltisini perfüzyon yapmayı düşünün. Bu, ca2+ ve hasarlı eritrositlerden salınan diğer malzemelerin olumsuz etkisini önlemeye yardımcı olabilir. İkinci olarak, bağlantıyı ayrıştırmak ve hücreler arasındaki boşluğu genişletmek için ca2+içermeyen çözeltinin perfüzyonlanması enzim sindiriminin etkinliğini artırabilir, çünkü CM’ler arasındaki intercalated diskler kalsiyuma bağımlı hücreler arası kavşaklardır. Bununla birlikte, kalsiyum paradoksu fenomeninden kaçınmak için süre 3-5 dakika ile sınırlanmalıdır24. Karışık bir enzim çözeltisi önerilir. Kollajenaz tip II hücre dışı matris ağını bozar ve kollajenaz II sindirimi eksikse tripin hücre yüzeyinde kalan granül malzemenin temizlenmesine yardımcı olur. Bu, yama kelepçe kaydında bir GΩ contası oluşturmak için kritik olan pürüzsüz bir hücre yüzeyi sağlar. Bununla birlikte, tripin konsantrasyonu aşırı sindirim ve hücre yaralanmasını önlemek için uygun aralıkta kontrol edilmelidir, çünkü membran proteinini bozabilir. Hücre verimini artırmak için tek başına kollajenaz tip II kullanmak genellikle sindirim üzerinde dokuya yol açabilir ve izole edilmiş CD’ler uzun süreli kollajenaz maruziyeti sonrası kalsiyum intoleransı olacaktır25. Miyozin ATPase’yi inhibe ederek ve köprüler arası oluşumu engelleyerek kendiliğinden kasılmayı önleyen bir madde olan 2,3 butanedione monoksim (BDM) kullanımı halen tartışmalıdır26,27,28,29. Önceki deneyime göre, bu protokol için BDM eklemek gereklidir. Enzim çözeltisi çözelti 1 ile hazırlanır, ancak çözelti 1 kalsiyum içermez ve enzimi aktive etmek için kalsiyum eklenir. Perfüzyon çözeltisinde BDM eklemenin yararı, (1) enzim çözeltisi perfüzyonu sırasında miyositlerin kasılmasını inhibe etmeyi ve oksijen tüketimini azaltmayı ve (2) miyositlerin hipoksiden önlenmesini ve izole edilmiş miyositlerin kalitesinin artırılmasını içerir. Bazı çalışmalar, BDM’nin hücresel elektriksel özellikler üzerinde potansiyel bir olumsuz etkisi olabileceğini bildirmektedir. Bununla birlikte, sodyum akımının tüm hücreli yama kelepçe kaydının sonuçları istenmeyen bir etkiye işaret etmedi. Hücre depolama adımında (adım 6), çok sayıda çalışma, hücrelerin polarize ve düşük metabolik koşullarda oldukları için daha iyi bir durum koruyabilecekleri kalsiyum içermeyen ancak yüksek potasyum konsantrasyonu çözümü olan KB tamponunu seçti. Bununla birlikte, hücre zarının glikokalipsi, belirli bir süre eksojen kalsiyum yokluğunda lipid bilayerden ayrılır ve membran geçirgenliği artarak sonraki fonksiyonel analizi etkiler30,31,32.
Tüm miyosit izolasyon teknikleri esasen şu anda enzymatic bir çözeltide öbek (küçük bir doku parçası) sindirimi veya enzymatic çözelti (Langendorff perfüzyonu) ile CA perfüzyonu olarak sınıflandırılabilir 22. Langendorff yöntemi ile karşılaştırıldığında, öbek sindirim yönteminin gerçekleştirilmesi daha kolaydır ve birçok laboratuvarda CD’leri izole etmek için rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntem normalde yetişkin dokularından düşük kalitede CD’ler üretir22. Ayrıca, bu yöntemle izole edilen hücreler karşılaştırmalı deneyler yapmak için uygun olmayabilir. Örneğin, ve VM arasındaki hücre tipine özgü ilaç etkileri test edilirken, farklı izolasyon koşullarının etkisi ihmal edilemez veya dışlanamaz. Bunun nedeni, miyokard ve ventrikülün doku yoğunluğunun atriyumdan çok daha kalın ve yoğun olmasıdır, bu da farklı sindirim süreleri ve enzim konsantrasyonları ile sonuçlanır. Ayrıca, sindirim sırasında dokunun aşırı ajitasyon ve pipetlenmesi hücrelere zarar verecek ve fonksiyonel çalışmaları önemli ölçüde etkileyecektir. Ayrıca, daha önceki birçok çalışma, AM’lerin kalsiyuma karşı daha savunmasız olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, mevcut protokol tarafından izole edilen AM’ler, muhtemelen sindirim sürecinin sonunda dokunun yırtılması kolay olduğu için gradyan kalsiyumun yeniden girişine karşı hoşgörülü olabilir. Bu nedenle, mekanik hasar daha azdır, oysa hücreler öbek yönteminin adımları tekrarlanan yırtılma ve santrifüje ihtiyaç duyduğundan daha fazla mekanik hasara uğrar. Daha yakın zamanda, Ackers ve arkadaşları, uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve nonmiyositlerin izolasyonu için basitleştirilmiş, Langendorff içermeyen bir yöntem bildirdi. VM’ler ve fibroblastlar etkili bir şekilde izole edilebilir, ancak AM’lerin miktarından bahsedilmedi. Ancak, bu protokolün birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, kalp kan damarlarının dağılımı bireysel farklılıklar ve fareler için gerginlik için varyasyonlara sahip olabilir ve önerilen kanülasyon derinliği her zaman için başarılı bir AMs izolasyonunu garanti edemez. İkincisi, bu prosedüre yeni başlayanlar için aort transeksiyonu ve retrograd aort kanülasyonu uygulamak belirli bir zaman alabilir. Son olarak, bu yöntem sağlıklı ve yaşlı fareler dışında diğer kalp hastalığı modellerinde test edildi. Bu nedenle, kalbin fibrozis boyutu nedeniyle enzim konsantrasyonlarında ve sindirim süresinde ayarlamalar gerektirecektir. Öbek yönteminde karşılaşılan farklı sindirim koşullarının dezavantajı, enzim çözeltisinin damar yatakları tarafından dokuya eşit olarak dağıtıldığı Langendorff yönteminde bir sorun olmayacaktır.
Özetle, burada açıklanan tek ve VM’nin eşzamanlı izolasyonu için protokoller, uygun aort kanülasyon derinliğinin atriyum perfüzyonunu ve verimini etkili bir şekilde iyileştirebileceğini göstermiştir. Bu yöntemle izole edilen CD’ler yüksek kalitededir, iyi kalsiyum toleransına sahiptir ve team34’te patch kelepçe kaydı ve kalsiyum elleçleme (IonOptix sistemi tarafından Ca2+ salınımı ve Ca2+ dalga ölçümü) için başarıyla uygulanmıştır. İzolasyon protokolünün, kardiyak fizyoloji ve patolojinin anlaşılmasını derinleştirmeye yardımcı olacak bir dizi hücresel ve hücre altı araştırmada hücre hazırlığı için kullanılabileceği öngörülmektedir. Daha da önemlisi, klinik olarak daha ilgili kalp hastalığı mekanizmalarının ve müdahale yöntemlerinin keşfedilmesini sağlayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7192051 No. Yazar katkıları: Bai ve Liu projeyi tasarladı ve tasarladı. Wen ve Ruan deneyler için değerli tavsiyelerde bulundular. Wu ve Linling Li deneysel çalışmayı yürüttüler ve veri toplama, analiz ve yorumlamada kilit roller oynadılar. Li, Langendorff aparat montajına katıldı. Peng, Zhang, Wang ve Yang deneyden önce reaktiflerin ve çözümlerin hazırlanmasına katıldılar. Makaleyi Wu yazdı.
2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
Excel | data acquisition and analysis | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
Water bath | JULABO | ED (v.2) |