成体マウスからの心房と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の改変

この論文は、大介カヌルの深さ(単に 深さと呼ばれる)として定義される大オータにカニューレ先端が位置するところ、大間が連結される場所も表している。昇順大オルタでカニューレートされ、結紮された心臓から分離されたAMおよびVMは、それぞれAMAAおよびVMAAとして表される。また、大動脈根でカニューレ化および連結された心臓から分離されたAMおよびVMは、それぞれAMARおよびVMARとして表される。 図2 は大動脈と横断位置の概要を示しています。また、 図3 は、大動脈の横断位置に対応する深さおよびライゲーション場所を示す。深さは、心房および心房の付属物の灌流に関連していた。両心房付属器は、カニューレ先端が上天大陸にあるときに膨脹し、十分な心房灌流を示す。しかし、大動脈根で、心房灌流が不十分であり、両方の心房付属物が拭き取られた(図4)。カルシウム再導入後の異なる深さで、カニュード心臓から分離されるCM形態と生存率(図5)。AMAA、AMAR、VMAA、およびVMARの細胞形態は、カルシウム再導入前後の共焦点顕微鏡下にあります。AM はスピンドル型ですが、VM は長方形の端を持つ棒状です。さらに、AM と VM には、膜が完全に残っており、輪郭がはっきりしていて、サルコメアがはっきりし、滑らかに表面化しています(図 6)。細胞生存率はトリパンブルー染色を介して評価した。無傷の膜を持つ正常な細胞はトリパンブルーを除外することができ、染色されませんが、細胞の損失活性は細胞内ですぐにトリパンブルーを蓄積します(図7)。AM と VM は、セルカウントを実行するために別のオブジェクト スライドに配置されました。AMの総収量と生存率(生存率)の割合は、細胞懸濁液の10μLを物体スライドに移し、4×10視野で反転相差顕微鏡で数えることによって決定した。同じ方法を使用して、VM の総収量 (棒状) と実行可能な VM の割合を決定しました。この方法は、そのサイズと形状のためにCMが容易にヘモサイトメーターの計面積に分配しなかったので、ヘモサイトメーターを使用する方が好ましい。棒グラフ(図8)は、カルシウム再導入前後のAMAA、AMAR、VMAA、およびVMARの生存率を示しています。各値は、10匹のマウスからのSD±平均を表す。カルシウム再導入前、AMAAの生存率はAMAR(70.9%±2.8%、41.0%±5.2%と比べて有意に高い。 p < 0.01)カルシウム再導入後、AMAAの生存率はAMAR(69.4%±3.0%、37.7%±4.9%とそれぞれ4.9%と比べて有意に高くなります。 p < 0.01) VMAAの生存率はVMARの生存率と変わらない(89.5%±2.7%対88.1%±2.6%; カルシウム 再導入前にp > 0.05)同様に、VMAAの生存率はVMARの生存率(82.2%±1.9%対82.9%±1.6%とそれぞれ異なっていなかった。 カルシウム 再導入後>0.05)。 このプロトコルが推奨する深さで心臓(上昇大オルタ)、カルシウム再導入後、実行可能なVMとAMの収量はそれぞれ約410万と約180,000です。単離されたAMおよびVMにおけるナトリウム電流(図9A、B)と電流密度(図9C)の全細胞パッチクランプ記録は、細胞の品質が電気生理学的実験の要件を満たしていることを確認した。大動脈の解剖学(図10)は、心房の血管のオチウムが大動脈根付近にあり、冠状動脈(CA)のオシウムに隣接していることを示している。 表3 は、カニューレ先端から、上昇大動脈および大動脈根で連結された心臓のCAオシウムまでの距離をそれぞれ示す。 図 1.組み立てられた変更されたランゲンドルフシステムの概略図。 このシステムは、ユーザーにとって経済的で携帯性が高い。それは水のためのプラスチック管1の2つの部分(内径、8 mm)およびパーフューザート(内径、1.5 mm)のための1つを有し、そのうち遠位端はLuerロックを備えたPE医学の三方停止所に接続される。熱交換器として、水とゴム栓を含むガラス瓶。パーフューサートは、蠕動ポンプによって熱交換器のプラスチックチューブに送り込まれ、カニューレに接続された三方向のストップコックから出てきます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2.大オルタと周りの組織。 「Y」形の血管構造は、大動脈とその枝である、腕頭筋動脈(矢印1)と左共通頸動脈(矢印2)である。左の一般的な頸動脈(緑色の線)の間の大動脈をトランセクトし、同時にいくつかのマウスで腕頭筋動脈を切断;他のマウスにおける昇順大オルタ(黒線)での経転(立体顕微鏡10×2倍)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 3.カニュールハートの正面図。 黒い曲線は、左の一般的な頸動脈の間に切り替えられた大動脈の切開端を表す。赤い曲線は、昇順大オルタでトランセクトされた大オルタの切開端を表します。直線は大動脈が結紮された場所を表します:上がる大動脈では黒、大動脈根では赤(実体顕微鏡10×2倍) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 4.カニュードハートの灌流状態。 心房は十分に浸透しており、両方の心房付属器は、心臓(A)でカニューレ化され、上昇大陸で結紮される。しかし、心房付属物はいずれも心臓(B)でカニューレ化され、大動脈根で結紮され、不十分なアトリア灌流を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 5.カルシウム再導入後の細胞形態と生存率評価 上昇大大通でカニューレートおよび結紮された心臓から分離されたAM(A)およびVM(B)は、それぞれAMAAおよびVMAAとして表される。大動脈根でカニューレートおよび結紮された心臓から分離されたAM(C)およびVM(D)は、それぞれAMARsおよびVAMORとして表される。高品質のCMは静止しており、無傷の膜、明確な輪郭、明確な縞質サルコメア、滑らかな細胞表面を持っています。AM はスピンドル型ですが、VM は棒またはレンガ状の形状で、長方形の端が付いています。膜内でブレブを自発的に収縮させたり含んでいるCMは質が悪く、球形に縮むCDは死んだ細胞です。ランダム視野(蛍光顕微鏡、10×10倍、スケールバー、100μm)。AM =心房筋細胞、VM=心室筋細胞。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 6.カルシウム再導入前後の共焦点顕微鏡下での細胞形態 カルシウム再導入前、AMAA(A)とAMAR(C)は、明確な輪郭、縞状のサルコメア、滑らかな膜表面を持つスピンドル状です。カルシウム再導入後、AMAA(B)とAMAR(D)は、明確な輪郭、縞状のサルコメア、滑らかな膜表面を持つスピンドル状でもあります。カルシウム再導入の前に、VMAA(E)とVMAR(G)は、明確な輪郭、線条体、および長方形の端を持つ滑らかな膜表面を持つ棒またはレンガ状です。カルシウム再導入後、VMAA(F)およびVMAR(H)は、明確な輪郭、縞状のサルコメア、および長方形の端を持つ滑らかな膜表面(共焦点顕微鏡油、63倍×10倍、スケールバー、50μm)を持つロッドまたはレンガ状の形状でもあります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 7.細胞生存率評価。 活性を失う損傷細胞は、トリパンブルーによって染色されます。対照的に、生細胞はトリパンブルー(蛍光顕微鏡、4×10倍、スケールバー、100μm)で染色することはできません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 8. カルシウム再導入前後のAMAA、AMAR、VMAA、およびVMARの生存率を示す棒グラフ。CR = カルシウム再導入。各値は、10匹のマウスからのSD±平均を表す。p < 0.01. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 解決 内容物(異なる方法で指定しない場合は、mmol/Lでの最終濃度) 著名 灌流液(溶液1) 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 タウリン, 5 グルコース, 10 2,3-ブタンジオン単一体 (BDM) 4°Cで3日間保存できます。 グルコース、 タウリンおよび BDM は実験の日に加えます。各心臓に対して200mLの灌流液を用意します。 タイロードのソリューション(ソリューション2) 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 グルコース 4°Cで3日間保存できます。 CaCl2 とグルコースは実験の日に加え、PHメーターで室温(28-30°C)で飽和NaOHで7.3-7.4にpHを調整します。 表 1.大人マウスCM分離のためのソリューション。 解決 内容 著名 消化液(溶液3) 25 mL溶液1、6μL 100 mM/L CaCl2、25mgコラゲローゼII、50μL(2.5×)トリプシン 各心臓について ソリューション 1 (ソリューション 4) を停止する 9 mL溶液 1,1 mL FBS (牛胎児血清), 4μL 100 mM/L CaCl2 各心臓について ソリューション 2(ソリューション 5) を停止する 9.5 mL溶液 1,0.5 mL FBS(胎児ウシ血清)、4μL 100 mM/L CaCl2 各心臓について 細胞リサスペンション溶液(溶液6) 13 mL溶液1、7μL 1M/L CaCl2、BSA(ブル血清アルブミン)は、液体の表面を覆う薄い層を形成することができる用量で 各心臓について 表 2.大人のマウスCMの分離および貯蔵のための解決。 図 9.ナトリウムチャネルの電流電圧曲線。全細胞パッチクランプ技術は、電圧クランプモードで孤立した心筋細胞のナトリウム電流を記録するために使用されました。電圧クランププロトコルは、差し込み中に示されています。AM(A)およびVM(B)から記録されたナトリウム電流を示す。−45mV、−40mV、および−35 mVの電位の電流密度は、AM(−32.71±1.597 pA/pF、−31.49±1.820 pA/pFで有意に高い。 および -29.34 ± 1.939 pA/pF、n = 10) VM (-17.66 pA/pF ± 1.976 pA/pF、-21.09 ± 1.560 pA/pF、および -21.86 ± 1.381 pA/pF; = 8; P < 0.05)。(C) I-V曲線は、細胞容量に正規化されたナトリウム電流密度を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図10。心房の起源と分布。 パネルAの心房(矢印1)とCA(矢印2)は、心房容器(矢印3)を詳しく見ている。(C) 2つの異なるサイズのオスティアが存在します。一方(矢印4)は、心房付属器を灌漑した心房容器に対応し、もう一方(矢印5)はCA(実体顕微鏡10×5倍)に対応する。CA = 冠状動脈. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 マウスのシリアル番号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 大大通りの深さは、上昇大オルタにあります 0.5 0.6 0.3 0.4 0.8 0.3 0.8 0.7 0.5 0.7 大動脈のカンヌレーションの深さは大動脈根にある 0.2 -0.1 0.1 0 -0.1 0.1 -0.2 0 -0.1 0 表 3.カニューレ先端から冠状動脈オシウムまでの距離。 C57BL/6マウスの心臓(n=20)をそれぞれ、上昇大動脈と大動脈根の深さで大動脈をカンニュートし、リゲートするために使用した。大オルタを解剖し、カニューレ先端からCAオシウムまでの距離を測定した。距離はミリメートル単位で測定され、正または負の兆候はCAオシウムの上下のカニューレ先端をそれぞれ表します。