Ce protocole décrit les modifications de la méthode de Langendorff, y compris la profondeur de la canulation de l’aorte pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes.
Un seul cardiomyocyte est un outil essentiel dans les études au niveau cellulaire et subcellulaire de la biologie cardiaque et des maladies en tant qu’unité fondamentale de contraction et d’activité électrique. Par conséquent, l’isolement des cardiomyocytes viables et de haute qualité du cœur est l’étape expérimentale initiale et la plus cruciale. En comparant les différents protocoles d’isolement des cardiomyocytes de souris adultes, la perfusion rétrograde de Langendorff est la méthode la plus efficace et la plus reproductible rapportée dans la littérature, en particulier pour isoler les myocytes ventriculaires. Cependant, l’isolement des myocytes auriculaires de qualité du cœur perfusé reste difficile, et peu de rapports d’isolement réussis sont disponibles. La résolution de ce problème compliqué est extrêmement importante car, outre les maladies ventriculaires, les maladies auriculaires représentent une grande partie des maladies cardiaques. Par conséquent, d’autres investigations au niveau cellulaire pour révéler les mécanismes sont justifiées. Dans cet article, un protocole basé sur la méthode de perfusion rétrograde de Langendorff est introduit et certaines modifications de la profondeur de la canulation de l’aorte et les étapes pouvant affecter le processus de digestion pour isoler les myocytes auriculaires et ventriculaires ont été apportées simultanément. De plus, il est confirmé que les cardiomyocytes isolés se prêtent à l’examen de la pince patch.
Les maladies cardiaques sont l’une des principales causes mondiales de mortalité1. Pour faire face à ce fardeau pour le système de santé, une compréhension approfondie de la physiologie et de la pathologie du cœur est essentielle. Outre la préparation de l’animal entier et du cœur intact, la préparation cellulaire est un autre outil indispensable pour l’étude fonctionnelle et de la maladie2. En appliquant la pince à patch, l’imagerie calcique, la biologie moléculaire et d’autres technologies avancées, les chercheurs peuvent obtenir plus d’informations sur les propriétés électrophysiologiques, l’homéostasie du calcium, les voies de signalisation, les états métaboliques et les transcriptions de gènes dans un seul cardiomyocyte (CM). Ceci est extrêmement utile pour révéler les mécanismes physiologiques et pathologiques du processus de la maladie cardiaque3,4,5,6,7. Pour la recherche animale, des espèces allant des petits animaux (p. ex., souris, rats et cochons d’Inde) aux grands animaux (p. ex., lapins et chiens) peuvent être utilisées. Les petits animaux sont généralement préférés, en particulier les souris, car ils se prêtent à la manipulation génétique et à la manipulation de modèles de maladie8,9,10.
Les techniques de CM isolés de manière aiguë ont connu une longue période de développement et continuent d’évoluer11. La perfusion rétrograde de Langendorff est la méthode d’isolement des CM la plus efficace et la plus reproductible appliquée chez le rat et la souris, en particulier pour isoler les myocytes ventriculaires (VM)12,13,14,15. Cependant, les rapports de myocytes auriculaires isolés avec succès sont rares16,17,18. D’autres recherches sur les deux niveaux de l’ensemble de l’organe / système et du cellulaire / subcellulaire pour révéler les mécanismes et explorer de nouvelles approches thérapeutiques sont justifiées parce que la fibrillation auriculaire (FA), le type d’arythmie le plus courant, devient de plus en plus répandue dans le monde entier, et les modalités de traitement actuelles dans les thérapies pharmacologiques et l’ablation cardiaque restent inefficaces chez environ 40% à 50% des patients atteints de FA19 . L’isolement réussi des CM de souris adultes est la première étape de l’étude cellulaire. Deux méthodes d’isolement principales peuvent être utilisées : les méthodes chunk et Langendorff. Dans la méthode de perfusion de Langendorff, la digestion des tissus dépend de la solution enzymatique délivrée par les artères coronaires et leurs branches aux lits capillaires. Une bonne profondeur de canulation de l’aorte qui peut éviter de pénétrer dans les valves aortiques et de bloquer l’artère coronaire est la condition préalable à la réalisation d’un tel schéma de perfusion, qui est également l’étape essentielle pour une digestion efficace et un rendement VM idéal. Par conséquent, il est raisonnable de supposer que la profondeur de la canulation de l’aorte peut également affecter la perfusion du vaisseau atria et finalement affecter le rendement am. Pour tester cette hypothèse, la canulation de l’aorte à différentes profondeurs a été effectuée et les rendements AM correspondants ont été comparés. Les données ont montré que la profondeur de canulation de l’aorte est directement liée au rendement de la FA. Ici, un protocole permettant d’isoler simultanément les AM et les VM est introduit.
La CM unique est un outil précieux et indispensable dans les études au niveau cellulaire de la fonction cardiaque et des maladies20. Par conséquent, l’isolement des CM viables des cœurs est l’étape initiale et la plus cruciale. La qualité cellulaire est l’un des déterminants importants de la réussite des expériences, en particulier dans les expériences optiques et électrophysiologiques. Par rapport aux CM d’autres animaux, les MC de rongeurs sont plus vulnérables à l’ischémie et à l’hypoxie en raison d’une concentration plus élevée d’ions sodium intracellulaires, ce qui favorise l’afflux de calcium par l’échangeur Na+/Ca2+221. De plus, le nombre d’AM est bien inférieur à celui des VM ; ainsi, une isolation réussie est extrêmement difficile à réaliser. La méthode langendorff est excellente pour isoler les souris VMs22, mais le taux de réussite dans l’isolement des AM est faible et peu de rapports sont disponibles. La bonne profondeur de canulation de l’aorte est également un facteur essentiel pour produire des VM idéales en dehors de la température, de l’activité enzymatique, du pH et de la qualité de l’eau utilisées pour la préparation des tampons. Le principe de la méthode Langendorff repose sur la perfusion rétrograde du cœur. Lors de la perfusion, la valve aortique est fermée; ainsi, le perfusat est forcé dans les artères coronaires, délivrant une solution enzymatique à travers les branches des vaisseaux, et le tissu myocardique est digéré uniformément. Pour obtenir ce type de schéma de circulation, l’aorte doit réserver suffisamment de longueur pour la canulation et la ligature, la pointe de la canule ne doit pas non plus pénétrer dans les valves aortiques ou bloquer l’ostium CA. Ainsi, il est raisonnable de spéculer que la profondeur de la canulation de l’aorte est également associée à la perfusion des oreillettes, ce qui affecte l’efficacité de la digestion des oreillettes et les rendements de la FA de la même manière. Le protocole présenté ici a confirmé l’hypothèse, et les étapes cruciales pour optimiser le rendement cellulaire ainsi que les suggestions sont notées ci-dessous.
À l’étape 1.9, pour mieux sécuriser l’aorte, une canule émoussée de 20 G avec une encoche (ou une rainure circonférentielle) d’où la distance est de 1 mm à la pointe est recommandée. D’après nos expériences, la taille de la canule qui est un peu plus grande que le diamètre de l’aorte a été trouvée pour empêcher la pointe de la canule de percer les valves aortiques pendant la canulation parce que l’aorte, en s’appuyant sur son élasticité intrinsèque, peut s’insérer parfaitement dans la canule et produire un frottement, ce qui agit comme un facteur de protection lors du réglage de la profondeur de canulation vers l’avant ou vers l’arrière. En termes de position de l’encoche, le cœur glissera facilement pendant la canulation à cause de la gravité s’il est trop près de la pointe de la canule. Inversement, l’espace pour ajuster la profondeur de canulation et la position de ligature sera très limité si trop loin. Compte tenu de ces circonstances, il est préférable de transecter l’aorte entre l’artère carotide commune gauche (comme la ligne verte de la figure 2) pour s’assurer que l’aorte est suffisamment longue et peut être canulée et ligaturée à l’aorte ascendante à l’étape 3.3. Alors que la transectisation à l’aorte ascendante, la longueur réservée à la canulation au moins pourrait fixer l’extrémité de la canule près de la racine aortique et ne pénétrera pas dans les valves aortiques après ligature. L’anatomie de l’aorte et la mesure de la distance entre l’extrémité de la canule et l’ostium CA indiquent que la transectisation de l’aorte entre l’artère carotide commune gauche est une position idéale pour obtenir une profondeur de canulation aorscale appropriée.
La profondeur de canulation s’est avérée associée à la perfusion des oreillettes, qui à son tour agit comme un indicateur de profondeur. La figure 4 montre que la perfusion des oreillettes est bonne lorsque la profondeur est à l’aorte ascendante et que les deux appendices auriculaires sont gonflés. Cependant, la perfusion des oreillettes est insuffisante lorsque la profondeur est à (ou s’approche) de la racine aortique et que les deux appendices auriculaires sont essuyés. Le nombre total et viable d’AM produit à partir des appendices auriculaires gonflés était plus élevé (figure 8). Ces résultats indiquent que la profondeur de canulation de l’aorte peut affecter la perfusion et la digestion des oreillettes et des appendices auriculaires d’une certaine manière et finalement affecter le rendement et la qualité de la FA. On a déduit que le rendement et la qualité de la FA étaient associés à la distribution des récipients qui alimentent les atriums. L’étude de Fernández et al.23 a démontré diverses anomalies dans l’origine et l’évolution de l’AC de la souris. Ils ont constaté que les AC ostia étaient très variables et n’étaient pas tous situés dans le sinus aortique. Certains AC peuvent provenir anormalement au-dessus des sinus aortiques, appelés ostium à décollage élevé. Certains CA peuvent provenir du même sinus aortique, et l’ostium du vaisseau de l’oreillette est juste à proximité. L’anatomie de l’aorte dans la présente étude (Figure 10) est également cohérente avec la découverte de Fernández. C’est peut-être la raison pour laquelle les tentatives d’isolement de la FA par la méthode langendorff ont été largement infructueuses si la profondeur de canulation n’est pas appropriée. Ainsi, la pointe de la canule aura plus de chances de bloquer l’ostium du vaisseau de l’oreillette qui est adjacent à l’ostium CA si l’espace disponible entre la pointe de la canule et l’ostium CA. En revanche, la perfusion et le rendement cellulaire du ventricule n’étaient guère affectés tant que les valves aortiques n’étaient pas pénétrées par l’extrémité de la canule. C’est probablement parce que les AC qui fournissent du sang au ventricule ont une plus grande ostie et plus d’origines. Si un ostium a été obstrué par la canule, la perfusion ventriculaire peut être compensée par un autre AC ou la circulation collatérale, tandis que le vaisseau sanguin qui alimente l’oreillette est plutôt petit et n’a pas de substitut. Ainsi, l’influence de la profondeur dans la canulation de l’aorte est importante.
D’autres facteurs et dépannages notables dans le processus de digestion et de stockage des cellules sont énumérés comme suit. Tout d’abord, envisagez de perfuser la solution de Tyrode oxygénée à l’étape 4.1 pour que le muscle se contracte et pompe le sang résiduel si le sang dans les oreillettes n’a pas été précipité après la ligature de l’aorte. Cela peut aider à éviter l’effet indésirable du ca2+ et d’autres matériaux libérés par les érythrocytes endommagés. Deuxièmement, infuser une solution sans ca2+ à l’avance pour dissocier la connexion et élargir l’espace entre les cellules peut améliorer l’efficacité de la digestion enzymatique, car les disques intercalés entre les CM sont des jonctions intercellulaires dépendantes du calcium. Cependant, le temps doit être limité à 3-5 min pour éviter le phénomène du paradoxe du calcium24. Une solution enzymatique mélangée est recommandée. La collagénase de type II perturbe le réseau de matrice extracellulaire et la trypsine aide à éliminer le matériau granulaire qui reste à la surface de la cellule si la digestion de la collagénase II est incomplète. Cela garantit une surface cellulaire lisse, ce qui est essentiel pour former un joint GΩ dans l’enregistrement de la pince de patch. Néanmoins, la concentration de trypsine doit être contrôlée dans la plage appropriée pour éviter la digestion excessive et les lésions cellulaires, car elle peut dégrader la protéine membranaire. L’utilisation de la collagénase de type II seule pour améliorer le rendement cellulaire peut souvent entraîner une digestion excessive des tissus, et les CM isolés seront intolérants au calcium après une exposition prolongée à la collagénase25. L’utilisation du 2,3-butanedione monoxime (BDM), une substance qui prévient la contraction spontanée en inhibant la myosine ATPase et en empêchant la formation de ponts croisés, est toujours controversée26,27,28,29. Selon l’expérience antérieure, l’ajout de BDM est nécessaire pour ce protocole. La solution enzymatique est préparée avec la solution 1 bien que la solution 1 ne contienne pas de calcium et que du calcium soit ajouté pour activer l’enzyme. L’avantage de l’ajout de BDM dans la solution de perfusion comprend (1) l’inhibition de la contraction des myocytes et la réduction de la consommation d’oxygène pendant la perfusion de la solution enzymatique et (2) la prévention de l’hypoxie des myocytes et l’amélioration de la qualité des myocytes isolés. Certaines études ont rapporté que le BDM peut avoir une influence négative potentielle sur les propriétés électriques cellulaires. Cependant, les résultats de l’enregistrement du courant de sodium par la pince de patch à cellules entières n’ont pas indiqué d’effet indésirable. Dans l’étape de stockage cellulaire (étape 6), de nombreuses études ont choisi le tampon KB, une solution sans calcium mais à forte concentration de potassium, dans laquelle les cellules peuvent maintenir un meilleur état car elles sont dans des conditions polarisées et métaboliques faibles. Cependant, le glycocalyx de la membrane cellulaire se séparera de la bicouche lipidique en l’absence de calcium exogène pendant un certain temps et la perméabilité de la membrane augmentera, affectant l’analyse fonctionnelle ultérieure30,31,32.
Toutes les techniques d’isolement des myocytes peuvent être essentiellement classées actuellement en digestion en morceaux (un petit morceau de tissu) dans une solution enzymatique ou en perfusion d’AC avec une solution enzymatique (la perfusion de Langendorff)22. Par rapport à la méthode de Langendorff, la méthode de digestion des morceaux est plus facile à effectuer et est également couramment utilisée pour isoler les CM dans de nombreux laboratoires. Cependant, cette méthode produit normalement un faible rendement de CM de mauvaise qualité à partir de tissus adultes22. De plus, les cellules isolées par cette méthode peuvent ne pas convenir à la réalisation d’expériences comparatives. Par exemple, lors de l’analyse des effets médicamenteux spécifiques au type de cellule entre la FA et la VM, l’impact de différentes conditions d’isolement ne peut être négligé ou exclu. En effet, le myocarde et la densité tissulaire du ventricule sont beaucoup plus épais et plus denses que celui de l’oreillette, ce qui entraîne des temps de digestion et des concentrations enzymatiques différents. En outre, une agitation et un pipetage excessifs des tissus pendant la digestion endommageront les cellules et auront un impact significatif sur les études fonctionnelles. De plus, de nombreuses études antérieures ont montré que les AM sont plus vulnérables au calcium. Cependant, les AM isolés par le protocole actuel peuvent tolérer la réintroduction du calcium de gradient, probablement parce que le tissu est facile à rompre à la fin du processus de digestion. Ainsi, les dommages mécaniques sont moindres, alors que les cellules subiraient plus de dommages mécaniques car les étapes de la méthode du morceau nécessitent une rupture répétée et centrifuge. Plus récemment, Ackers et al.33 ont rapporté une méthode simplifiée et sans Langendorff pour l’isolement de myocytes et de non-myocytes cardiaques viables. Les VM et les fibroblastes peuvent être isolés efficacement, mais la quantité de VM n’a pas été mentionnée. Cependant, ce protocole présente plusieurs limitations. Tout d’abord, la distribution des vaisseaux sanguins cardiaques peut avoir des variations pour les différences individuelles et la souche de souris, et la profondeur de canulation recommandée ne peut pas garantir un isolement réussi des AM pour chaque fois. Deuxièmement, pour ceux qui sont nouveaux à cette procédure peut prendre un certain temps pour pratiquer la transsection de l’aorte et la canulation de l’aorte rétrograde. Enfin, cette méthode n’a pas été testée dans d’autres modèles de maladies cardiaques, sauf chez des souris en bonne santé et âgées. Par conséquent, il faudra des ajustements dans les concentrations enzymatiques et le temps de digestion en raison de l’étendue de la fibrose du cœur. L’inconvénient des différentes conditions de digestion rencontrées dans la méthode du morceau ne sera pas un problème dans la méthode de Langendorff dans laquelle la solution enzymatique est répartie uniformément dans le tissu par les lits de vaisseaux.
En résumé, les protocoles pour l’isolement simultané d’une seule FA et VM décrits ici ont démontré que la profondeur de canulation de l’aorte appropriée peut améliorer efficacement la perfusion de l’oreillette et le rendement de la FA. Les CM isolés par cette méthode sont de haute qualité, possèdent une bonne tolérance au calcium et ont été appliqués avec succès à l’enregistrement de la pince de patch et à la manipulation du calcium (libération de Ca2+ et mesure des ondes Ca2+ par le système IonOptix) dans l’équipe34. On s’attend à ce que le protocole d’isolement puisse être utilisé pour la préparation cellulaire dans une série d’investigations cellulaires et subcellulaires, ce qui aidera à approfondir la compréhension de la physiologie et de la pathologie cardiaques. Il est important de noter qu’il permettra la découverte de mécanismes et de méthodes d’intervention plus pertinents sur le plan clinique des maladies cardiaques.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) et de la Fondation des sciences naturelles de Beijing (n ° 7192051). Contributions de l’auteur : Bai et Liu ont conçu et conçu le projet. Wen et Ruan ont fourni de précieux conseils pour les expériences. Wu et Linling Li ont effectué les travaux expérimentaux et ont joué un rôle clé dans l’acquisition, l’analyse et l’interprétation des données. Li a participé à l’assemblage de l’appareil Langendorff. Peng, Zhang, Wang et Yang ont participé à la préparation des réactifs et des solutions avant l’expérience. Wu a écrit l’article.
2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
Excel | data acquisition and analysis | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
Water bath | JULABO | ED (v.2) |