Modificaties van de Langendorff-methode voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen

Single CM is een waardevol en onmisbaar hulpmiddel in cellulaire niveau studies van hartfunctie en ^ziekten20. Daarom is de isolatie van levensvatbare CM’s van de harten de eerste en meest cruciale stap. Celkwaliteit is een van de belangrijke determinanten van het uitvoeren van succesvolle experimenten, vooral in optische en elektrofysiologische experimenten. In vergelijking met de CM’s van andere dieren zijn Knaagdier-CM’s kwetsbaarder voor ischemie en hypoxie vanwege een hogere concentratie intracellulaire natriumionen, wat de calciuminstroom via de Na ⁺ / ^{Ca2 +} –^wisselaar21 bevordert. Bovendien is het aantal AM’s veel kleiner dan dat van VM’s; succesvolle isolatie is dus uiterst moeilijk te bereiken. De Langendorff-methode is uitstekend voor het isoleren van muizen-VM’s22, maar het slagingspercentage bij het isoleren van AM’s is laag en er zijn weinig rapporten beschikbaar. De juiste diepte van aorta-cannulatie is ook een essentiële factor bij het produceren van ideale VM’s, afgezien van temperatuur, enzymactiviteit, PH en waterkwaliteit die worden gebruikt voor buffervoorbereiding. Het principe van de Langendorff-methode is gebaseerd op retrograde perfusie van het hart. Bij perfusie is de aortaklep gesloten; daardoor wordt het perfusaat in de kransslagaders geperst, waarbij enzymoplossing door de vaattakken wordt afgeleverd en het myocardiale weefsel gelijkmatig wordt verteerd. Om een dergelijk circulatiepatroon te bereiken, moet de aorta voldoende lengte reserveren voor cannulatie en ligatie, ook de canulepunt mag de aortakleppen niet binnendringen of het CA ostium blokkeren. Het is dus redelijk om te speculeren dat de diepte van aorta-cannulatie ook geassocieerd is met atriaperfusie, die de spijsvertering van de atria en de opbrengsten van AM op een vergelijkbare manier beïnvloedt. Het hier gepresenteerde protocol bevestigde de hypothese en cruciale stappen voor het optimaliseren van de celopbrengst samen met de suggesties worden hieronder vermeld.

In stap 1.9, om de aorta beter vast te zetten, wordt een stompe canule van 20 G aanbevolen met een inkeping (of een omtrekgroef) van waaruit de afstand 1 mm tot de punt is. Op basis van onze ervaringen bleek de canulegrootte die iets groter is dan de diameter van de aorta te voorkomen dat de canulepunt de aortakleppen doorboort tijdens de cannulatie, omdat de aorta, afhankelijk van zijn intrinsieke elasticiteit, goed in de canule kan passen en wrijving kan produceren, wat fungeert als een beschermende factor bij het vooruit of achteruit bewegen van de cannulatiediepte. In termen van de positie van de inkeping zal het hart gemakkelijk afglijden tijdens de cannulatie vanwege de zwaartekracht als het te dicht bij de canulepunt is. Omgekeerd zal de ruimte voor het aanpassen van de cannulatiediepte en ligatiepositie zeer beperkt zijn als deze te ver is. Gezien deze omstandigheden is het beter om de aorta tussen de linker gemeenschappelijke halsslagader (zoals de groene lijn in figuur 2) te transeceren om ervoor te zorgen dat de aorta lang genoeg is en kan worden gecannuleerd en geligeerd bij de opgaande aorta in stap 3.3. Terwijl transecting bij de opgaande aorta, de gereserveerde lengte voor cannulatie op zijn minst de canulepunt dicht bij de aortawortel zou kunnen beveiligen en na ligatie niet in de aortakleppen zal doordringen. De anatomie van de aorta en de meting van de afstand van de canulepunt tot het CA ostium geven aan dat het transeceren van de aorta tussen de linker gemeenschappelijke halsslagader een ideale positie is om een goede aorta cannulatiediepte te bereiken.

Cannulatiediepte bleek geassocieerd te zijn met de perfusie van de boezems, die op zijn beurt fungeert als een diepte-indicator. Figuur 4 laat zien dat de atriaperfusie goed is wanneer de diepte bij de opgaande aorta ligt en beide atriale aanhangsels zijn opgeblazen. Atriaperfusie is echter onvoldoende wanneer de diepte bij (of in de buurt van) de aortawortel ligt en beide atriale aanhangsels zijn gewizened. De totale en levensvatbare telling van AM die werd verkregen uit de opgeblazen atriale aanhangsels was hoger (figuur 8). Deze bevindingen geven aan dat de cannulatiediepte van de aorta de perfusie en vertering van de boezems en atriale aanhangsels op een bepaalde manier kan beïnvloeden en uiteindelijk de AM-opbrengst en -kwaliteit kan beïnvloeden. De opbrengst en kwaliteit van AM werden afgeleid in verband met de verdeling van de vaten die de boezems bevoorraden. De studie van Fernández et ^al.23 heeft verschillende anomalieën aangetoond in de oorsprong en het verloop van muis CA. Ze ontdekten dat de CA’s ostia zeer variabel waren en zich niet allemaal in de aorta-sinus bevonden. Sommige CA’s kunnen abnormaal van boven de aortabijholten ontstaan, het hoge take-off ostium genoemd. Sommige CA’s kunnen afkomstig zijn van dezelfde aorta-sinus en het ostium van het atriumvat is net in de buurt. De anatomie van de aorta in deze studie (figuur 10) komt ook overeen met de bevinding van Fernández. Dit kan de oorzaak zijn waarom pogingen om AM te isoleren volgens de Langendorff-methode grotendeels zijn mislukt als de cannulatiediepte niet geschikt is. De canulepunt heeft dus een grotere kans om het atriumvat ostium dat grenst aan het CA ostium te blokkeren als er niet genoeg ruimte beschikbaar is tussen de canulepunt en het CA ostium. Daarentegen werden de perfusie en celopbrengst van de ventrikel nauwelijks beïnvloed zolang de aortakleppen niet door de canulepunt werden gepenetreerd. Dit komt waarschijnlijk omdat de CA’s die bloed leveren aan de ventrikel grotere ostia en meer oorsprong hebben. Als een ostium werd afgesloten door de canule, kan ventrikelperfusie worden gecompenseerd door een andere CA of de collaterale circulatie, terwijl het bloedvat dat het atrium voedt vrij klein is en geen vervanging heeft. De invloed van de diepte in aorta cannulatie is dus belangrijk.

Andere opmerkelijke factoren en probleemoplossingen in het verterings- en celopslagproces worden als volgt vermeld. Overweeg eerst om de oplossing van zuurstofhoudende Tyrode in stap 4.1 te perfuseren om de spier te laten samentrekken en restbloed weg te pompen als het bloed in de boezems niet is gehaast na aortaligatie. Dit kan helpen het nadelige effect van ^{ca2 +} en andere materialen die vrijkomen uit de beschadigde erytrocyten te voorkomen. Ten tweede kan het vooraf doordrenken van ^ca2+-vrije oplossing om de verbinding te dissociëren en de ruimte tussen cellen uit te breiden de werkzaamheid van enzymvertering verbeteren, omdat geïncaleerde schijven tussen CM’s calciumafhankelijke intercellulaire juncties zijn. De tijd moet echter worden beperkt tot 3-5 minuten om het calciumparadoxfenomeen te ^voorkomen24. Een gemengde enzymoplossing wordt aanbevolen. Collagenase type II verstoort het extracellulaire matrixnetwerk en trypsine helpt het korrelige materiaal dat op het celoppervlak achterblijft te verwijderen als collagenase II-vertering onvolledig is. Dit zorgt voor een glad celoppervlak, wat van cruciaal belang is voor het vormen van een GΩ-afdichting in de patchklemregistratie. Niettemin moet de trypsineconcentratie in het juiste bereik worden gecontroleerd om oververtering en celbeschadiging te voorkomen, omdat het het membraaneiwit kan afbreken. Het gebruik van collagenase type II alleen om de celopbrengst te verbeteren, kan vaak leiden tot weefselovergang, en de geïsoleerde CM’s zullen calciumintolerantie hebben na langdurige blootstelling aan ^{collagenase25}. Het gebruik van 2,3-butanedione monoxime (BDM), een stof die spontane contractie voorkomt door het myosine ATPase te remmen en dwarsbrugvorming te voorkomen, is nog steeds controversieel26,27,28,29. Volgens eerdere ervaring is het toevoegen van BDM noodzakelijk voor dit protocol. Enzymoplossing wordt bereid met oplossing 1, hoewel oplossing 1 geen calcium bevat en calcium wordt toegevoegd om het enzym te activeren. Het voordeel van het toevoegen van BDM in de perfusieoplossing omvat (1) het remmen van de contractie van myocyten en het verminderen van het zuurstofverbruik tijdens perfusie van enzymoplossing en (2) het voorkomen van myocyten van hypoxie en het verbeteren van de kwaliteit van de geïsoleerde myocyten. Sommige studies meldden dat BDM een potentieel nadelige invloed kan hebben op cellulaire elektrische eigenschappen. De resultaten van de hele-cel patchklemregistratie van de natriumstroom wezen echter niet op een ongewenst effect. In de celopslagstap (stap 6) hebben tal van studies gekozen voor de KB-buffer, een calciumvrije maar hoge kaliumconcentratieoplossing, waarin cellen een betere toestand kunnen behouden omdat ze zich in gepolariseerde en lage metabolische omstandigheden bevinden. De glycocalyx van het celmembraan zal echter gedurende een bepaalde tijd scheiden van de lipide bilaag in afwezigheid van exogene calcium en de membraandoorlaatbaarheid zal toenemen, wat de daaropvolgende functionele analyse ^{beïnvloedt30,31,32}.

Alle myocytenisolatietechnieken kunnen momenteel in wezen worden onderverdeeld in ofwel brok (een klein stukje weefsel) spijsvertering in een enzymatische oplossing of CA-perfusie met enzymatische oplossing (de Langendorff-perfusie)²². In vergelijking met de Langendorff-methode is de brokkenvergistingsmethode gemakkelijker uit te voeren en wordt deze in veel laboratoria ook routinematig gebruikt voor het isoleren van CM’s. Deze methode produceert echter normaal gesproken een lage opbrengst van CM’s van slechte kwaliteit uit volwassen ^weefsels22. Bovendien zijn cellen die met deze methode worden geïsoleerd mogelijk niet geschikt voor het uitvoeren van vergelijkende experimenten. Bijvoorbeeld, bij het testen van de celtype-specifieke geneesmiddeleffecten tussen AM en VM, kan de impact van verschillende isolatieomstandigheden niet worden verwaarloosd of uitgesloten. Dit komt omdat het myocardium en de weefseldichtheid van de ventrikel veel dikker en dichter zijn dan die van het atrium, wat resulteert in verschillende verteringstijden en enzymconcentraties. Bovendien zal overmatige agitatie en pipettering van het weefsel tijdens de spijsvertering de cellen beschadigen en functionele studies aanzienlijk beïnvloeden. Bovendien hebben veel eerdere studies aangetoond dat AM’s kwetsbaarder zijn voor calcium. AM’s die door het huidige protocol worden geïsoleerd, kunnen echter tolerant zijn voor gradiëntcalciumherintroductie, waarschijnlijk omdat het weefsel aan het einde van het verteringsproces gemakkelijk te scheuren is. Mechanische schade is dus minder, terwijl cellen meer mechanische schade zouden lijden omdat stappen van de brokkenmethode herhaalde breuk en centrifugaal nodig hebben. Meer recent rapporteerden Ackers et ^al.33 een vereenvoudigde, Langendorff-vrije methode voor de isolatie van levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten. De VM’s en de fibroblasten kunnen effectief worden geïsoleerd, maar de hoeveelheid van de AM’s werd niet genoemd. Dit protocol heeft echter verschillende beperkingen. Ten eerste kan de verdeling van de hartbloedvaten variaties hebben voor individuele verschillen en muizenstam, en de aanbevolen cannulatiediepte kan geen succesvolle AM-isolatie voor elke keer garanderen. Ten tweede, voor degenen die nieuw zijn in deze procedure kan het een bepaalde hoeveelheid tijd duren om aorta-transsectie en retrograde aorta-cannulatie te oefenen. Ten slotte werd deze methode niet getest in andere modellen voor hartziekten, behalve bij gezonde en oudere muizen. Daarom zal het aanpassingen in enzymconcentraties en tijd van spijsvertering vereisen vanwege de fibrose-omvang van het hart. Het nadeel van verschillende verteringsomstandigheden die bij de brokkenmethode worden aangetroffen, zal geen probleem zijn in de Langendorff-methode waarbij de enzymoplossing gelijkmatig door de vaatbedden over het weefsel wordt verdeeld.

Samenvattend hebben de protocollen voor de gelijktijdige isolatie van enkelvoudige AM en VM die hier worden beschreven, aangetoond dat de juiste aorta-cannulatiediepte de atriumperfusie en AM-opbrengst effectief kan verbeteren. De CMs die door deze methode worden geïsoleerd, zijn van hoge kwaliteit, beschikken over een goede calciumtolerantie en zijn met succes toegepast op patchklemregistratie en calciumbehandeling (^{Ca2 +} release en ^{Ca2 +} golfmeting door het IonOptix-systeem) in het ^team34. Verwacht wordt dat het isolatieprotocol kan worden gebruikt voor celvoorbereiding in een reeks cellulaire en subcellulaire onderzoeken, die zullen helpen het begrip van hartfysiologie en pathologie te verdiepen. Belangrijk is dat het de ontdekking van meer klinisch relevante mechanismen voor hartziekten en interventiemethoden mogelijk maakt.