Tahılların ve baklagillerin serbest çözünür fenolik asit bileşimini ve antioksidan kapasitesini belirlemek için genelleştirilmiş bir yöntem
Summary
Fenolik asitler, kepekli tahıllarda bulunan önemli fitokimyasallardır. Antioksidan koruyucu fonksiyonlar gibi biyoaktif özelliklere sahiptirler. Bu çalışma, HPLC tanımlaması, toplam fenolik içerik tahmini ve tahıl ve baklagillerde fenolik asitlerin antioksidan kapasitesinin belirlenmesi için genelleştirilmiş bir yöntemin raporlanmasını amaçlamıştır.
Abstract
Fenolik asitler, hem fenolik bir grubu hem de bir karboksilik grubu taşıyan bir organik bileşik sınıfıdır. Tahıllarda bulunurlar ve tahılların kepeğinde veya baklagillerin tohum kabuğunda yoğunlaşırlar. Son yıllarda potansiyel antioksidan koruyucu sağlık işlevleri hakkında çok fazla araştırma ilgisi yaratan antioksidan özelliklere sahiptirler. Bu çalışma, serbest çözünür fenolik asitlerin kepekli tahıllardan ekstraksiyonu ve antioksidan kapasitelerinin analizi için genelleştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. İki tahıl (buğday ve sarı mısır) ve üç baklagilden (börülce fasulyesi, barbunya fasulyesi ve soya fasulyesi) oluşan beş tam tahıl örneği kullanılmıştır. Taneler un haline getirildi ve serbest çözünür fenolik asitleri sulu metanol kullanılarak ekstrakte edildi. Bileşikler daha sonra yüksek basınçlı sıvı kromatografı (HPLC) kullanılarak tanımlandı. Toplam fenolik içeriklerini belirlemek için Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılırken, antioksidan kapasiteleri DPPH radikal süpürme kapasitesi, Trolox eşdeğer antioksidan kapasitesi (TEAC) ve oksijen radikal absorbans kapasitesi (ORAC) testleri kullanılarak belirlendi. Tanımlanan fenolik asitler vanillik, kafeik, p-kumarik ve ferulik asitleri içeriyordu. Vanillik asit sadece börülcede tanımlanırken, kafeik asit sadece böbrek fasulyesinde tanımlanmıştır. p-Kumarik asit sarı mısır, börülce ve soya fasulyesinde tanımlanırken, tüm örneklerde ferulik asit tanımlanmıştır. Ferulik asit, tanımlanan baskın fenolik asitti. Numunelerdeki fenolik asitlerin toplam konsantrasyonu aşağıdaki sırayla azalmıştır: soya fasulyesi > börülce fasulyesi > sarı mısır = buğday > barbunya fasulyesi. Toplam antioksidan kapasitesi (DPPH, TEAC ve ORAC tahlillerinin değerlerinin toplamı) aşağıdaki gibi azalmıştır: soya fasulyesi > böbrek fasulyesi > sarı mısır = börülce fasulyesi > buğday. Bu çalışma, HPLC analizinin yanı sıra DPPH, TEAC ve ORAC tahlillerinin kepekli tahılların fenolik asit bileşimi ve antioksidan özellikleri hakkında yararlı bilgiler sağladığı sonucuna varmıştır.
Introduction
Fenolik asitler, otçul ve mantar enfeksiyonuna karşı bitki savunmasında oynadıkları hayati rol ve bitki dokularında yapısal destek ve bütünlüğün korunmasından dolayı bitkilerde incelenen en önemli fitokimyasallar arasındadır 1,2. Tahılların kepeğinde ve baklagillerin tohum kabuğunda bol miktarda bulunurlar3. Yapısal olarak, iki gruba ayrılırlar: hidroksibenzoik asitler (Şekil 1) ve hidroksisinnamik asitler (Şekil 2). Tahıllarda ve baklagillerde yaygın hidroksibenzoik asitler gallik, p-hidroksibenzoik, 2,4-dihidroksibenzoik, protokateşik, vanillik ve şırıngalik asitleri içerirken, yaygın hidroksisinnamik asitler kafeik, p-kumarik, ferulik ve sinapik asitleri içerir3. Fenolik asitler ayrıca yağlarda oksidatif kokululuğa neden olan serbest radikalleri temizleyebildikleri ve fizyolojik sistemlerde radikal kaynaklı oksidatif stresi başlatıp çoğaltabildikleri için antioksidan özelliklere sahiptirler 4,5. Antioksidanlar olarak bu hayati fizyolojik rol nedeniyle, son araştırmaların konusudur. Bunun nedeni, bitkisel gıdaların bileşenleri olarak tüketildiğinde, antioksidan koruma uygulayabilmeleridir.
Tahıllar ve tahıl ürünleri, dünya çapında insanlar ve hayvanlar için başlıca karbonhidrat besin kaynaklarıdır6. Tahıllar arasında buğday, pirinç, mısır (mısır), arpa, tritikale, darı ve sorgum bulunur. Bunlar arasında, 2019/2020 yıllarında tahmini 1.135,7 milyon ton küresel kullanım ile mısır en çok kullanılanıdır, bunu aynı dönemde tahmini 757,5 milyon ton küresel kullanım ile buğday izlemektedir7. Tahıl gıdaları, zengin karbonhidrat kaynakları oldukları için tüketiciler için harika enerji kaynaklarıdır. Ayrıca bazı protein, yağ, lif, vitamin ve mineraller sağlarlar6. Besin değerlerine ek olarak, tahıllar, fizyolojik sistemi radikal kaynaklı oksidatif hasardan koruma potansiyeline sahip fitokimyasal antioksidanların, özellikle fenolik asitlerin iyi kaynaklarıdır3. Baklagiller de iyi besin kaynaklarıdır ve genellikle protein bakımından tahıllardan daha yüksektir. Ayrıca vitamin ve mineral içerirler ve çeşitli yiyeceklerin hazırlanmasında kullanılırlar8. Ek olarak, baklagiller fenolik asitler, flavonoidler, antosiyaninler ve proantosiyanidinler 9,10 dahil olmak üzere çeşitli fitokimyasal antioksidanların iyi kaynaklarıdır. Farklı tahıl ve baklagil çeşitleri farklı bir fenolik asit bileşimine sahip olabilir. Bu nedenle, fenolik antioksidanlarla ilgili potansiyel sağlık yararlarını bilmek için tahılların ve baklagillerin fenolik asit bileşimini ve çeşitlerini incelemeye ihtiyaç vardır.
Tahıl ve baklagil tanelerindeki fenolik asitlerin miktarını ölçmek ve antioksidan aktivitelerini belirlemek için bir dizi tahlil bildirilmiştir. Tam tahıllı fenolik asitler için en yaygın analiz yöntemleri spektrofotometri ve sıvı kromatografisi11’dir. Bu çalışmanın amacı, serbest çözünür fenolik asit bileşimini belirlemek için genelleştirilmiş yüksek basınçlı sıvı kromatografik bir yöntem ve bazı tam tahıllı tahılların ve baklagillerin toplam fenolik içeriğini ve antioksidan kapasitesini belirlemek için spektrofotometrik yöntemleri göstermektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kepekli tahıllar, dünya çapında geniş gıda uygulamaları bulan temsili tahıl taneleri ve baklagiller olarak seçildi. Her tahılın çeşitleri arasında farklılıklar olsa da, bu çalışmanın odak noktası, tam tahıllar için serbest fenolik asit ekstraksiyonu ve analizi için genelleştirilmiş bir yöntem göstermekti. Ekstraksiyon yöntemi, bu tür deneyler yapıldığında çevreye salınacak kimyasalların miktarını azaltmak için numune ve çözücü miktarlarını önemli ölçüde azaltarak değişt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Bayan Alison Ser ve Bayan Hannah Oduro-Obeng’in teknik desteğinin yanı sıra Bayan Janice Fajardo ve Bay Miguel del Rosario’nun video düzenleme desteğini minnetle kabul etmektedir.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
