Um método generalizado para determinar a composição livre de ácido fenólico solúvel e capacidade antioxidante de cereais e leguminosas
Summary
Ácidos fenólicos são fitoquímicos importantes que estão presentes em grãos integrais. Possuem propriedades bioativas, como funções protetoras antioxidantes. Este trabalho teve como objetivo relatar um método generalizado para a identificação do HPLC, estimativa total de teor fenólico e determinação da capacidade antioxidante de ácidos fenólicos em cereais e leguminosas.
Abstract
Ácidos fenólicos são uma classe de compostos orgânicos que carregam tanto um grupo fenólico, quanto um grupo carboxílico. Eles são encontrados em grãos e se concentram no farelo de cereais ou sementes de leguminosas. Possuem propriedades antioxidantes que geraram muito interesse de pesquisa nos últimos anos, sobre suas potenciais funções de proteção antioxidante. Este trabalho apresenta um método generalizado para a extração de ácidos fenólicos solúveis livres de grãos integrais e análise de sua capacidade antioxidante. Foram utilizadas cinco amostras integrais de grãos compostos por dois cereais (trigo e milho amarelo) e três leguminosas (feijão-de-vaca, feijão-rim e soja). Os grãos foram moídos em farinha e seus ácidos fenólicos solúveis livres extraídos usando metanol aquoso. Os compostos foram então identificados por meio de um cromatógrafo líquido de alta pressão (HPLC). O método Folin-Ciocalteu foi usado para determinar seu teor fenólico total, enquanto suas capacidades antioxidantes foram determinadas usando a capacidade radical de limpeza do DPPH, capacidade antioxidante equivalente trolox (TEAC) e ensaios de capacidade de absorção radical de oxigênio (ORAC). Os ácidos fenólicos identificados incluíam ácidos vanlícíacos, cafeíacos, p-coumaricos e ferúlicos. O ácido vanlícía foi identificado apenas em cowpea, enquanto o ácido cafeico foi identificado apenas no feijão renal. p-coumíaco ácido foi identificado em milho amarelo, vaquinha e soja, enquanto o ácido ferúlico foi identificado em todas as amostras. O ácido ferúlico foi o ácido fenólico predominante identificado. A concentração total de ácidos fenólicos nas amostras diminuiu na seguinte ordem: soja > feijão-de-couro > milho amarelo = feijão-rim > trigo. A capacidade antioxidante total (soma dos valores dos ensaios DPPH, TEAC e ORAC) diminuiu da seguinte forma: soja > feijão-rim > milho amarelo = feijão de ervilha > trigo. Este estudo concluiu que a análise do HPLC, bem como os ensaios DPPH, TEAC e ORAC fornecem informações úteis sobre a composição do ácido fenólico e propriedades antioxidantes de grãos integrais.
Introduction
Os ácidos fenólicos estão entre os fitoquímicos mais importantes estudados nas plantas devido ao papel vital que desempenham na defesa vegetal contra a infecção herbívora e fúngica, bem como a manutenção do suporte estrutural e integridade nos tecidos vegetais 1,2. Eles são abundantes no farelo de cereais e sementes de leguminosas3. Estruturalmente, eles são divididos em dois grupos: os ácidos hidroxibenóicos (Figura 1) e os ácidos hidroxicinâmicos (Figura 2). Os ácidos hidroxibenóicos comuns em cereais e leguminosas incluem ácidos gálicos, p-hidroxibenóicos, 2,4-dihidroxibenóicos, protocatecáricos, vanlícías e seringéricos, enquanto os ácidos hidroxicinnômicos comuns incluem ácidos caficos, p-coumaric, ferulicos e sinapicácidos 3. Os ácidos fenólicos também possuem propriedades antioxidantes, pois são capazes de ressarcimento de radicais livres, que causam ranço oxidativo nas gorduras, e iniciam e propagam estresse oxidativo induzido por radicais nos sistemas fisiológicos 4,5. Devido a esse papel fisiológico vital como antioxidantes, eles são objeto de pesquisas recentes. Isso porque quando consumidos como componentes de alimentos vegetais, eles podem exercer proteção antioxidante.
Cereais e produtos cereais são as principais fontes de alimentos carboidratos para humanos e animais em todo o mundo6. Os cereais incluem trigo, arroz, milho (milho), cevada, triticale, milhetas e sorgo. Entre eles, o milho é o mais utilizado, com uma utilização global estimada de 1.135,7 milhões de toneladas em 2019/2020, seguido pelo trigo com uma utilização global estimada de 757,5 milhões de toneladas no mesmo período7. Os alimentos cereais são ótimas fontes de energia para os consumidores, uma vez que são fontes ricas de carboidratos. Eles também fornecem algumas proteínas, gorduras, fibras, vitaminas e minerais6. Além de seu valor nutricional, os cereais são boas fontes de antioxidantes fitoquímicos, particularmente ácidos fenólicos, que têm o potencial de proteger o sistema fisiológico de danos oxidativos induzidos por radicais3. As leguminosas também são boas fontes de nutrientes e geralmente são mais altas em proteínas do que os cereais. Eles também contêm vitaminas e minerais e são usados na preparação de vários alimentos8. Além disso, as leguminosas são boas fontes de uma variedade de antioxidantes fitoquímicos, incluindo ácidos fenólicos, flavonoides, antocianinas e proanthocyanidins 9,10. Diferentes variedades de cereais e leguminosas podem ter uma composição diferente de ácido fenólico. Há, portanto, a necessidade de estudar a composição do ácido fenólico de cereais e leguminosas e suas variedades, a fim de conhecer seus potenciais benefícios para a saúde em relação aos antioxidantes fenólicos.
Uma série de ensaios foram relatados para medir a quantidade de ácidos fenólicos em grãos de cereais e leguminosas, e determinar suas atividades antioxidantes. Os métodos de análise mais comuns para ácidos fenólicos de grãos integrais são espectrofotometria e cromatografia líquida11. O objetivo deste trabalho foi demonstrar um método cromatógrafo líquido de alta pressão generalizado para determinar a composição livre de ácido fenólico solúvel e métodos espectrofotométricos para determinar o teor fenólico total e a capacidade antioxidante de alguns cereais e leguminosas de grãos integrais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os grãos integrais foram selecionados como grãos de cereais e leguminosas representativas que encontram amplas aplicações alimentares em todo o mundo. Embora possam existir variações entre cultivares de cada grão, o foco deste estudo foi demonstrar um método generalizado de extração e análise de ácido fenólico gratuito para grãos integrais. O método de extração foi modificado reduzindo substancialmente as quantidades de amostras e solventes, a fim de reduzir a quantidade de produtos químicos que seriam …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio técnico da Sra. Alison Ser e da Sra. Hannah Oduro-Obeng, bem como o apoio de edição de vídeo da Sra. Janice Fajardo e do Sr. Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
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