Un método generalizado para determinar la composición del ácido fenólico soluble libre y la capacidad antioxidante de los cereales y las legumbres
Summary
Los ácidos fenólicos son fitoquímicos importantes que están presentes en los granos enteros. Poseen propiedades bioactivas como funciones protectoras antioxidantes. Este trabajo tuvo como objetivo informar sobre un método generalizado para la identificación de HPLC, la estimación del contenido fenólico total y la determinación de la capacidad antioxidante de los ácidos fenólicos en cereales y legumbres.
Abstract
Los ácidos fenólicos son una clase de compuestos orgánicos que tienen tanto un grupo fenólico como un grupo carboxílico. Se encuentran en los granos y se concentran en el salvado de los cereales o la capa de semillas de las legumbres. Poseen propiedades antioxidantes que han generado mucho interés de investigación en los últimos años, sobre sus posibles funciones antioxidantes protectoras de la salud. Este trabajo presenta un método generalizado para la extracción de ácidos fenólicos solubles libres de granos enteros y el análisis de su capacidad antioxidante. Se utilizaron cinco muestras de granos enteros que comprenden dos cereales (trigo y maíz amarillo) y tres legumbres (caupí, frijol y soja). Los granos se molían en harina y sus ácidos fenólicos solubles libres se extraían utilizando metanol acuoso. Los compuestos se identificaron utilizando un cromatógrafo de líquidos de alta presión (HPLC). El método Folin-Ciocalteu se utilizó para determinar su contenido fenólico total, mientras que sus capacidades antioxidantes se determinaron utilizando los ensayos de capacidad de eliminación de radicales DPPH, capacidad antioxidante equivalente (TEAC) de Trolox y capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC). Los ácidos fenólicos identificados incluyeron ácidos vanílico, cafeico, p-cumárico y ferúlico. El ácido vanílico se identificó solo en el caupí, mientras que el ácido cafeico se identificó solo en el frijol. El ácido p-cumárico se identificó en el maíz amarillo, el caupí y la soja, mientras que el ácido ferúlico se identificó en todas las muestras. El ácido ferúlico fue el ácido fenólico predominante identificado. La concentración total de ácidos fenólicos en las muestras disminuyó en el siguiente orden: soja > caupí > maíz amarillo = frijol > trigo. La capacidad antioxidante total (suma de valores de los ensayos DPPH, TEAC y ORAC) disminuyó de la siguiente manera: soja > frijol > maíz amarillo = caupí > trigo. Este estudio concluyó que el análisis de HPLC, así como los ensayos DPPH, TEAC y ORAC proporcionan información útil sobre la composición del ácido fenólico y las propiedades antioxidantes de los granos enteros.
Introduction
Los ácidos fenólicos se encuentran entre los fitoquímicos más importantes estudiados en las plantas debido al papel vital que desempeñan en la defensa de las plantas contra la herbivoría y la infección por hongos, así como en el mantenimiento del soporte estructural y la integridad en los tejidos vegetales 1,2. Son abundantes en el salvado de cereales y en la capa de semillas de legumbres3. Estructuralmente, se dividen en dos grupos: los ácidos hidroxibenzoico (Figura 1) y los ácidos hidroxicinámicos (Figura 2). Los ácidos hidroxibenzoicos comunes en cereales y legumbres incluyen ácidos gálico, p-hidroxibenzoico, 2,4-dihidroxibenzoico, protocatecúico, vanílico y sirígrico, mientras que los ácidos hidroxicinámicos comunes incluyen ácidos cafeico, p-cumárico, ferúlico y sinápico3. Los ácidos fenólicos también poseen propiedades antioxidantes, ya que son capaces de eliminar los radicales libres, que causan rancidez oxidativa en las grasas, e iniciar y propagar el estrés oxidativo inducido por radicales en los sistemas fisiológicos 4,5. Debido a este papel fisiológico vital como antioxidantes, son objeto de investigaciones recientes. Esto se debe a que cuando se consumen como componentes de alimentos vegetales, pueden ejercer protección antioxidante.
Los cereales y los productos de cereales son las principales fuentes de alimentos con carbohidratos para humanos y animales en todo el mundo6. Los cereales incluyen trigo, arroz, maíz (maíz), cebada, triticale, mijo y sorgo. Entre ellos, el maíz es el más utilizado, con una utilización global estimada de 1.135,7 millones de toneladas en 2019/2020, seguido del trigo con una utilización global estimada de 757,5 millones de toneladas durante el mismo período7. Los alimentos de cereales son grandes fuentes de energía para los consumidores, ya que son fuentes ricas en carbohidratos. También aportan algo de proteínas, grasas, fibra, vitaminas y minerales6. Además de su valor nutricional, los cereales son buenas fuentes de antioxidantes fitoquímicos, particularmente ácidos fenólicos, que tienen el potencial de proteger el sistema fisiológico del daño oxidativo inducido por radicales3. Las legumbres también son buenas fuentes de nutrientes y generalmente son más altas en proteínas que los cereales. También contienen vitaminas y minerales y se utilizan en la preparación de diversos alimentos8. Además, las legumbres son buenas fuentes de una variedad de antioxidantes fitoquímicos, incluidos ácidos fenólicos, flavonoides, antocianinas y proantocianidinas 9,10. Diferentes variedades de cereales y legumbres pueden tener una composición de ácido fenólico diferente. Por lo tanto, existe la necesidad de estudiar la composición de ácido fenólico de los cereales y las legumbres y sus variedades, con el fin de conocer sus posibles beneficios para la salud con respecto a los antioxidantes fenólicos.
Se han reportado varios ensayos para medir la cantidad de ácidos fenólicos en granos de cereales y leguminosas, y determinar sus actividades antioxidantes. Los métodos de análisis más comunes para los ácidos fenólicos de grano entero son la espectrofotometría y la cromatografía líquida11. El objetivo de este trabajo fue demostrar un método cromatográfico líquido generalizado de alta presión para determinar la composición del ácido fenólico soluble libre, y métodos espectrofotométricos para determinar el contenido fenólico total y la capacidad antioxidante de algunos cereales y legumbres integrales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los granos enteros fueron seleccionados como granos de cereales representativos y legumbres que encuentran amplias aplicaciones alimentarias en todo el mundo. Si bien pueden existir variaciones entre los cultivares de cada grano, el enfoque de este estudio fue demostrar un método generalizado para la extracción y análisis de ácido fenólico libre para granos enteros. El método de extracción se modificó reduciendo sustancialmente las cantidades de muestras y disolventes, con el fin de reducir la cantidad de product…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo técnico de la Sra. Alison Ser y la Sra. Hannah Oduro-Obeng, así como el apoyo a la edición de vídeo de la Sra. Janice Fajardo y el Sr. Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
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