Обобщенный метод определения состава свободных растворимых фенольных кислот и антиоксидантной способности зерновых и бобовых культур
Summary
Фенольные кислоты являются важными фитохимическими веществами, которые присутствуют в цельных зернах. Они обладают биологически активными свойствами, такими как антиоксидантные защитные функции. Эта работа была направлена на представление информации об обобщенном методе идентификации ВЭЖХ, оценке общего фенольного содержания и определении антиоксидантной способности фенольных кислот в зерновых и бобовых культурах.
Abstract
Фенольные кислоты представляют собой класс органических соединений, которые несут как фенольную группу, так и карбоновую группу. Они содержатся в зернах и концентрируются в отрубях злаков или семенной оболочке бобовых. Они обладают антиоксидантными свойствами, которые вызвали большой исследовательский интерес в последние годы, об их потенциальных антиоксидантных защитных функциях здоровья. В данной работе представлен обобщенный метод экстракции свободных растворимых фенольных кислот из цельного зерна и анализа их антиоксидантной способности. Было использовано пять образцов цельного зерна, включающих два зерновых (пшеница и желтая кукуруза) и три бобовых (коровий горох, фасоль почек и соя). Зерна перемалывали в муку, а их свободные растворимые фенольные кислоты извлекали с использованием водного метанола. Затем соединения были идентифицированы с помощью жидкого хроматографа высокого давления (ВЭЖХ). Метод Фолина-Чокалтеу был использован для определения их общего фенольного содержания, в то время как их антиоксидантные способности были определены с использованием анализа радикальной поглотительной способности DPPH, эквивалентной антиоксидантной способности Тролокса (TEAC) и абсорбционной способности кислородных радикалов (ORAC). Выявленные фенольные кислоты включали ванильную, кофейную, п-кумаровую и феруловую кислоты. Ванильная кислота была идентифицирована только в коровьем горохе, в то время как кофейная кислота была идентифицирована только в почечных бобах. p-кумаровая кислота была идентифицирована в желтой кукурузе, коровьем горохе и сое, в то время как феруловая кислота была идентифицирована во всех образцах. Феруловая кислота была преобладающей фенольной кислотой. Общая концентрация фенольных кислот в образцах снижалась в следующем порядке: соевый > коровий горох > желтая кукуруза = фасоль > пшеницы. Общая антиоксидантная способность (сумма значений анализов DPPH, TEAC и ORAC) снизилась следующим образом: соевые > почечные бобы > желтая кукуруза = коровий горох > пшеница. Это исследование пришло к выводу, что анализ ВЭЖХ, а также анализы DPPH, TEAC и ORAC предоставляют полезную информацию о составе фенольных кислот и антиоксидантных свойствах цельных зерен.
Introduction
Фенольные кислоты являются одними из наиболее важных фитохимических веществ, изучаемых в растениях, из-за жизненно важной роли, которую они играют в защите растений от травоядных и грибковых инфекций, а также в поддержании структурной поддержки и целостности в тканях растений 1,2. Их много в отрубях злаков и семенной оболочке бобовых3. Структурно они делятся на две группы: гидроксибензойные кислоты (рис. 1) и гидроксикоричные кислоты (рис. 2). Общие гидроксибензойные кислоты в зерновых и бобовых включают галловую, п-гидроксибензойную, 2,4-дигидроксибензойную, протокатеховую, ванильную и сиринговую кислоты, в то время как общие гидроксикоричные кислоты включают кофейную, п-кумаровую, феруловую и синаповую кислоты3. Фенольные кислоты также обладают антиоксидантными свойствами, поскольку они способны поглощать свободные радикалы, которые вызывают окислительную прогорклость в жирах, а также инициировать и распространять индуцированный радикалами окислительный стресс в физиологических системах 4,5. Из-за этой жизненно важной физиологической роли в качестве антиоксидантов они являются предметом недавних исследований. Это связано с тем, что при употреблении в качестве компонентов растительной пищи они могут оказывать антиоксидантную защиту.
Зерновые и зерновые продукты являются основными источниками углеводной пищи для людей и животных во всем мире6. Зерновые включают пшеницу, рис, кукурузу (кукурузу), ячмень, тритикале, просо и сорго. Среди них кукуруза является наиболее используемой, с предполагаемым глобальным использованием 1 135,7 млн. тонн в 2019/2020 году, за которой следует пшеница с предполагаемым глобальным использованием 757,5 млн. тонн за тот же период7. Зерновые продукты являются отличными источниками энергии для потребителей, поскольку они являются богатыми источниками углеводов. Они также содержат некоторые белки, жиры, клетчатку, витамины и минералы6. В дополнение к своей питательной ценности, зерновые являются хорошими источниками фитохимических антиоксидантов, особенно фенольных кислот, которые обладают потенциалом для защиты физиологической системы от радикально-индуцированного окислительного повреждения3. Бобовые также являются хорошими источниками питательных веществ и, как правило, содержат больше белка, чем зерновые. Они также содержат витамины и минералы и используются при приготовлении различных продуктовпитания 8. Кроме того, бобовые являются хорошими источниками различных фитохимических антиоксидантов, включая фенольные кислоты, флавоноиды, антоцианы и проантоцианидины 9,10. Разные сорта злаков и бобовых могут иметь разный состав фенольной кислоты. Поэтому необходимо изучить состав фенольных кислот зерновых и бобовых культур и их сортов, чтобы узнать их потенциальную пользу для здоровья в отношении фенольных антиоксидантов.
Сообщалось о ряде анализов для измерения количества фенольных кислот в зерновых и бобовых культурах и определения их антиоксидантной активности. Наиболее распространенными методами анализа цельнозерновых фенольных кислот являются спектрофотометрия и жидкостная хроматография11. Целью данной работы была демонстрация обобщенного жидкого хроматографического метода высокого давления для определения состава свободнорастворимой фенольной кислоты и спектрофотометрических методов определения общего фенольного содержания и антиоксидантной способности некоторых цельнозерновых злаков и бобовых культур.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цельные зерна были отобраны в качестве репрезентативных зерновых и бобовых, которые находят широкое применение в пищевых продуктах во всем мире. Хотя между сортами каждого зерна могут существовать различия, основное внимание в этом исследовании было уделено демонстрации обобщенного …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с признательностью отмечают техническую поддержку г-жи Элисон Сер и г-жи Ханны Одуро-Обенг, а также поддержку в редактировании видеофильмов г-жой Дженис Фахардо и г-ном Мигелем дель Росарио.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
