Un metodo generalizzato per determinare la composizione dell'acido fenolico solubile libero e la capacità antiossidante di cereali e legumi
Summary
Gli acidi fenolici sono importanti sostanze fitochimiche presenti nei cereali integrali. Possiedono proprietà bioattive come le funzioni protettive antiossidanti. Questo lavoro mirava a riportare un metodo generalizzato per l’identificazione dell’HPLC, la stima del contenuto fenolico totale e la determinazione della capacità antiossidante degli acidi fenolici nei cereali e nei legumi.
Abstract
Gli acidi fenolici sono una classe di composti organici che portano sia un gruppo fenolico che un gruppo carbossilico. Si trovano nei cereali e si concentrano nella crusca dei cereali o nel rivestimento dei semi dei legumi. Possiedono proprietà antiossidanti che hanno generato molto interesse di ricerca negli ultimi anni, sulle loro potenziali funzioni antiossidanti protettive per la salute. Questo lavoro presenta un metodo generalizzato per l’estrazione di acidi fenolici solubili liberi da cereali integrali e l’analisi della loro capacità antiossidante. Sono stati utilizzati cinque campioni di cereali integrali comprendenti due cereali (grano e mais giallo) e tre legumi (fagiolo, fagiolo e soia). I grani venivano macinati in farina e i loro acidi fenolici solubili liberi estratti usando metanolo acquoso. I composti sono stati quindi identificati utilizzando un cromatografo liquido ad alta pressione (HPLC). Il metodo Folin-Ciocalteu è stato utilizzato per determinare il loro contenuto fenolico totale, mentre le loro capacità antiossidanti sono state determinate utilizzando i saggi DPPH radical scavenging, Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) e oxygen radical absorbance capacity (ORAC). Gli acidi fenolici identificati includevano acidi vanillico, caffeico, p-cumarico e ferulico. L’acido vanillico è stato identificato solo nel fagiolo mentre l’acido caffeico è stato identificato solo nel fagiolo. L’acido p-cumarico è stato identificato nel mais giallo, nel fagiolo e nella soia, mentre l’acido ferulico è stato identificato in tutti i campioni. L’acido ferulico era l’acido fenolico predominante identificato. La concentrazione totale di acidi fenolici nei campioni è diminuita nel seguente ordine: soia > fagiolo > mais giallo = fagiolo > grano. La capacità antiossidante totale (somma dei valori dei saggi DPPH, TEAC e ORAC) è diminuita come segue: soia > fagiolo > mais giallo = fagiolo di mucca > grano. Questo studio ha concluso che l’analisi HPLC e i saggi DPPH, TEAC e ORAC forniscono informazioni utili sulla composizione dell’acido fenolico e sulle proprietà antiossidanti dei cereali integrali.
Introduction
Gli acidi fenolici sono tra i più importanti fitochimici studiati nelle piante a causa del ruolo vitale che svolgono nella difesa delle piante contro le infezioni erbivore e fungine, oltre a mantenere il supporto strutturale e l’integrità nei tessuti vegetali 1,2. Sono abbondanti nella crusca di cereali e nel rivestimento di semi di legumi3. Strutturalmente, sono divisi in due gruppi: gli acidi idrossibenzoici (Figura 1) e gli acidi idrossicinnamici (Figura 2). Gli acidi idrossibenzoici comuni nei cereali e nei legumi includono acido gallico, p-idrossibenzoico, 2,4-diidrossibenzoico, protocatechuico, vanillico e siringico, mentre gli acidi idrossicinnamici comuni includono gli acidi caffeico, p-cumarico, ferulico e sinapico3. Gli acidi fenolici possiedono anche proprietà antiossidanti poiché sono in grado di eliminare i radicali liberi, che causano irrancidimento ossidativo nei grassi, e avviare e propagare lo stress ossidativo indotto dai radicali nei sistemi fisiologici 4,5. A causa di questo ruolo fisiologico vitale come antiossidanti, sono oggetto di recenti ricerche. Questo perché se consumati come componenti di alimenti vegetali, possono esercitare una protezione antiossidante.
I cereali e i prodotti a base di cereali sono le principali fonti di cibo a base di carboidrati per l’uomo e gli animali in tutto il mondo6. I cereali includono grano, riso, mais (mais), orzo, triticale, miglio e sorgo. Tra questi, il mais è il più utilizzato, con un utilizzo globale stimato di 1.135,7 milioni di tonnellate nel 2019/2020, seguito dal grano con un utilizzo globale stimato di 757,5 milioni di tonnellate nello stesso periodo7. Gli alimenti a base di cereali sono grandi fonti di energia per i consumatori poiché sono ricche fonti di carboidrati. Forniscono anche alcune proteine, grassi, fibre, vitamine e minerali6. Oltre al loro valore nutrizionale, i cereali sono buone fonti di antiossidanti fitochimici, in particolare acidi fenolici, che hanno il potenziale per proteggere il sistema fisiologico dal danno ossidativo indotto dai radicali3. I legumi sono anche buone fonti di nutrienti e sono generalmente più ricchi di proteine rispetto ai cereali. Contengono anche vitamine e minerali e sono utilizzati nella preparazione di vari alimenti8. Inoltre, i legumi sono buone fonti di una varietà di antiossidanti fitochimici, tra cui acidi fenolici, flavonoidi, antociani e proantocianidine 9,10. Diverse varietà di cereali e legumi possono avere una diversa composizione di acido fenolico. C’è quindi la necessità di studiare la composizione dell’acido fenolico di cereali e legumi e delle loro varietà, al fine di conoscere i loro potenziali benefici per la salute rispetto agli antiossidanti fenolici.
Sono stati riportati numerosi saggi per misurare la quantità di acidi fenolici nei cereali e nei legumi e determinare le loro attività antiossidanti. I metodi più comuni di analisi per gli acidi fenolici integrali sono la spettrofotometria e la cromatografia liquida11. Lo scopo di questo lavoro era quello di dimostrare un metodo cromatografico liquido generalizzato ad alta pressione per determinare la composizione dell’acido fenolico solubile libero e metodi spettrofotometrici per determinare il contenuto fenolico totale e la capacità antiossidante di alcuni cereali integrali e legumi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I cereali integrali sono stati selezionati come cereali rappresentativi e legumi che trovano ampie applicazioni alimentari in tutto il mondo. Mentre possono esistere variazioni tra le cultivar di ciascun grano, l’obiettivo di questo studio è stato quello di dimostrare un metodo generalizzato per l’estrazione di acido fenolico libero e l’analisi per i cereali integrali. Il metodo di estrazione è stato modificato riducendo sostanzialmente la quantità di campioni e solventi, al fine di ridurre la quantità di sostanze ch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il supporto tecnico di Alison Ser e Hannah Oduro-Obeng, nonché il supporto al montaggio video di Janice Fajardo e Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
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