طريقة معممة لتحديد تكوين حمض الفينوليك القابل للذوبان الحر والقدرة المضادة للأكسدة للحبوب والبقوليات
Summary
الأحماض الفينولية هي مواد كيميائية نباتية مهمة موجودة في الحبوب الكاملة. أنها تمتلك خصائص نشطة بيولوجيا مثل وظائف الحماية المضادة للأكسدة. يهدف هذا العمل إلى الإبلاغ عن طريقة معممة لتحديد HPLC ، وتقدير إجمالي محتوى الفينول ، وتحديد القدرة المضادة للأكسدة للأحماض الفينولية في الحبوب والبقوليات.
Abstract
الأحماض الفينولية هي فئة من المركبات العضوية التي تحمل كلا من مجموعة الفينول ومجموعة كربوكسيلية. توجد في الحبوب وتتركز في نخالة الحبوب أو معطف بذور البقوليات. لديهم خصائص مضادة للأكسدة التي ولدت الكثير من الاهتمام البحثي في السنوات الأخيرة ، حول وظائفهم الصحية الوقائية المضادة للأكسدة المحتملة. يقدم هذا العمل طريقة معممة لاستخراج الأحماض الفينولية القابلة للذوبان الحرة من الحبوب الكاملة وتحليل قدرتها المضادة للأكسدة. تم استخدام خمس عينات من الحبوب الكاملة تتكون من حبوبين (القمح والذرة الصفراء) وثلاث بقوليات (حبوب اللوبيا والفاصوليا الكلوية وفول الصويا). تم طحن الحبوب إلى دقيق واستخراج الأحماض الفينولية القابلة للذوبان الحرة باستخدام الميثانول المائي. ثم تم تحديد المركبات باستخدام كروماتوغراف سائل عالي الضغط (HPLC). تم استخدام طريقة Folin-Ciocalteu لتحديد محتواها الفينولي الكلي بينما تم تحديد قدراتها المضادة للأكسدة باستخدام قدرة الكسح الجذري DPPH ، وقدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox (TEAC) وقدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC). وشملت الأحماض الفينولية التي تم تحديدها أحماض الفانيليك والكافيين والكوماريك والفيروليك. تم تحديد حمض الفانيليك فقط في اللوبيا بينما تم تحديد حمض الكافيين فقط في حبوب الكلى. تم تحديد حمض p-Coumaric في الذرة الصفراء واللوبيا وفول الصويا ، في حين تم تحديد حمض الفيروليك في جميع العينات. كان حمض الفيروليك هو حمض الفينوليك السائد الذي تم تحديده. انخفض التركيز الكلي للأحماض الفينولية في العينات بالترتيب التالي: فول الصويا > اللوبيا > الذرة الصفراء = الفاصوليا الكلوية > القمح. انخفضت القدرة الكلية المضادة للأكسدة (مجموع قيم اختبارات DPPH و TEAC و ORAC) على النحو التالي: فول الصويا > والفاصوليا > الذرة الصفراء = حبة اللوبيا > القمح. خلصت هذه الدراسة إلى أن تحليل HPLC بالإضافة إلى اختبارات DPPH و TEAC و ORAC توفر معلومات مفيدة حول تكوين حمض الفينول والخصائص المضادة للأكسدة للحبوب الكاملة.
Introduction
الأحماض الفينولية هي من بين أهم المواد الكيميائية النباتية التي تمت دراستها في النباتات بسبب الدور الحيوي الذي تلعبه في الدفاع عن النبات ضد العدوى العاشبة والفطرية ، وكذلك الحفاظ على الدعم الهيكلي والسلامة في الأنسجة النباتية 1,2. فهي وفيرة في نخالة الحبوب ومعطف البذور من البقوليات3. من الناحية الهيكلية ، يتم تقسيمها إلى مجموعتين: أحماض هيدروكسي بنزويك (الشكل 1) وأحماض الهيدروكسي سيناميك (الشكل 2). تشمل أحماض الهيدروكسي بنزويك الشائعة في الحبوب والبقوليات أحماض الجاليك و p-hydroxybenzoic و 2,4-dihydroxybenzoic و protocatechuic و vanillic و syringic ، في حين أن أحماض الهيدروكسي سيناميك الشائعة تشمل أحماض الكافيك و p-coumaric و ferulic و sinapic3. تمتلك الأحماض الفينولية أيضا خصائص مضادة للأكسدة لأنها قادرة على مسح الجذور الحرة ، والتي تسبب التزنخ التأكسدي في الدهون ، وبدء ونشر الإجهاد التأكسدي الناجم عن الجذور في الأنظمة الفسيولوجية 4,5. بسبب هذا الدور الفسيولوجي الحيوي كمضادات للأكسدة ، فهي موضوع بحث حديث. هذا لأنه عند استهلاكها كمكونات للأطعمة النباتية ، يمكنها ممارسة حماية مضادة للأكسدة.
الحبوب ومنتجات الحبوب هي مصادر غذائية رئيسية للكربوهيدرات للبشر والحيوانات في جميع أنحاء العالم6. وتشمل الحبوب القمح والأرز والذرة (الذرة) والشعير والتريتيكال والدخن والذرة الرفيعة. ومن بين هذه الذرة، الذرة هي الأكثر استخداما، حيث يقدر الاستخدام العالمي بنحو 1,135.7 مليون طن في 2019/2020، يليها القمح مع استخدام عالمي يقدر بنحو 757.5 مليون طن خلال نفس الفترة7. تعد أطعمة الحبوب مصادر رائعة للطاقة للمستهلكين لأنها مصادر غنية بالكربوهيدرات. كما أنها توفر بعض البروتين والدهون والألياف والفيتامينات والمعادن6. بالإضافة إلى قيمتها الغذائية ، تعد الحبوب مصادر جيدة لمضادات الأكسدة الكيميائية النباتية ، وخاصة الأحماض الفينولية ، والتي لديها القدرة على حماية النظام الفسيولوجي من الأضرار التأكسدية الناجمة عن الجذور3. البقوليات هي أيضا مصادر جيدة للمغذيات وهي عموما أعلى في البروتين من الحبوب. كما أنها تحتوي على الفيتامينات والمعادن وتستخدم في إعداد الأطعمة المختلفة8. بالإضافة إلى ذلك ، البقوليات هي مصادر جيدة لمجموعة متنوعة من مضادات الأكسدة الكيميائية النباتية ، بما في ذلك الأحماض الفينولية ، والفلافونويد ، والأنثوسيانين ، والبروانثوسيانيدينات9،10. قد يكون لأنواع مختلفة من الحبوب والبقوليات تركيبة حمض فينولية مختلفة. لذلك هناك حاجة لدراسة تكوين حمض الفينوليك للحبوب والبقوليات وأصنافها ، من أجل معرفة فوائدها الصحية المحتملة فيما يتعلق بمضادات الأكسدة الفينولية.
تم الإبلاغ عن عدد من الفحوصات لقياس كمية الأحماض الفينولية في الحبوب والبقوليات ، وتحديد أنشطتها المضادة للأكسدة. الطرق الأكثر شيوعا لتحليل الأحماض الفينولية للحبوب الكاملة هي قياس الطيف الضوئي والكروماتوغرافيا السائلة11. كان الهدف من هذا العمل هو إظهار طريقة كروماتوغرافية سائلة معممة عالية الضغط لتحديد تكوين حمض الفينول القابل للذوبان الحر ، وطرق الطيف الضوئي لتحديد المحتوى الفينولي الكلي والقدرة المضادة للأكسدة لبعض الحبوب الكاملة والبقوليات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم اختيار الحبوب الكاملة كحبوب وبقوليات تمثيلية للحبوب التي تجد تطبيقات غذائية واسعة في جميع أنحاء العالم. في حين قد توجد اختلافات بين أصناف كل حبة ، كان تركيز هذه الدراسة هو إظهار طريقة معممة لاستخراج وتحليل حمض الفينول الحر للحبوب الكاملة. تم تعديل طريقة الاستخراج عن طريق تقليل كميات ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعرب صاحبا البلاغ عن امتنانهما للدعم التقني الذي قدمته السيدة أليسون سير والسيدة هانا أودورو – أوبينغ، فضلا عن الدعم الذي قدمته السيدة جانيس فاجاردو والسيد ميغيل ديل روزاريو لتحرير الفيديو.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
