Eine verallgemeinerte Methode zur Bestimmung der frei löslichen Phenolsäurezusammensetzung und der antioxidativen Kapazität von Getreide und Hülsenfrüchten
Summary
Phenolsäuren sind wichtige sekundäre Pflanzenstoffe, die in Vollkornprodukten vorhanden sind. Sie besitzen bioaktive Eigenschaften wie antioxidative Schutzfunktionen. Diese Arbeit zielte darauf ab, über eine verallgemeinerte Methode zur HPLC-Identifizierung, zur Schätzung des Gesamtphenolgehalts und zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität von Phenolsäuren in Getreide und Hülsenfrüchten zu berichten.
Abstract
Phenolsäuren sind eine Klasse organischer Verbindungen, die sowohl eine phenolische Gruppe als auch eine Carbongruppe tragen. Sie kommen in Körnern und Konzentrat in der Kleie von Getreide oder Samenschale von Hülsenfrüchten vor. Sie besitzen antioxidative Eigenschaften, die in den letzten Jahren viel Forschungsinteresse an ihren potenziellen antioxidativen schützenden Gesundheitsfunktionen geweckt haben. Diese Arbeit stellt eine verallgemeinerte Methode zur Extraktion von frei löslichen Phenolsäuren aus Vollkornprodukten und zur Analyse ihrer antioxidativen Kapazität vor. Es wurden fünf Vollkornproben verwendet, die aus zwei Getreidearten (Weizen und gelber Mais) und drei Hülsenfrüchten (Kuhbohnen, Kidneybohnen und Sojabohnen) bestanden. Die Körner wurden zu Mehl gemahlen und ihre frei löslichen Phenolsäuren mit wässrigem Methanol extrahiert. Die Verbindungen wurden dann mit einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographen (HPLC) identifiziert. Die Folin-Ciocalteu-Methode wurde verwendet, um ihren Gesamtphenolgehalt zu bestimmen, während ihre antioxidativen Kapazitäten unter Verwendung der DPPH-Radikalfängerkapazität, der Trolox-äquivalenten antioxidativen Kapazität (TEAC) und der Sauerstoffradikalabsorptionskapazität (ORAC) bestimmt wurden. Zu den identifizierten Phenolsäuren gehörten Vanill-, Kaffee-, p-Cumarsäure und Ferulasäure. Vanillinsäure wurde nur in Kuhbohnen identifiziert, während Kaffeesäure nur in Kidneybohnen identifiziert wurde. p-Coumarsäure wurde in gelbem Mais, Kuhbohnen und Sojabohnen identifiziert, während Ferulasäure in allen Proben identifiziert wurde. Ferulasäure war die vorherrschende Phenolsäure, die identifiziert wurde. Die Gesamtkonzentration der Phenolsäuren in den Proben nahm in der folgenden Reihenfolge ab: Sojabohnen > Kuhbohnenbohnen > gelber Mais = Kidneybohnen > Weizen. Die gesamte antioxidative Kapazität (Summe der Werte von DPPH-, TEAC- und ORAC-Assays) nahm wie folgt ab: Sojabohnen > Kidneybohnen > gelber Mais = Kuhbohnenbohnen > Weizen. Diese Studie kam zu dem Schluss, dass HPLC-Analysen sowie DPPH-, TEAC- und ORAC-Assays nützliche Informationen über die Phenolsäurezusammensetzung und die antioxidativen Eigenschaften von Vollkornprodukten liefern.
Introduction
Phenolsäuren gehören zu den wichtigsten Phytochemikalien, die in Pflanzen untersucht werden, da sie eine wichtige Rolle bei der Pflanzenabwehr gegen Pflanzenfresser und Pilzinfektionen spielen und die strukturelle Unterstützung und Integrität im Pflanzengewebeaufrechterhalten werden 1,2. Sie sind reichlich in der Kleie von Getreide und Samenmantel von Hülsenfrüchten3. Strukturell werden sie in zwei Gruppen unterteilt: die Hydroxybenzoesäuren (Abbildung 1) und die Hydroxyzimtsäuren (Abbildung 2). Die üblichen Hydroxybenzoesäuren in Getreide und Hülsenfrüchten umfassen Gallus-, p-Hydroxybenzoesäure, 2,4-Dihydroxybenzoe, Protokatechusäure, Vanillsäure und Spritzwassersäure, während die üblichen Hydroxyzimtsäuren Kaffee-, p-Cumarin-, Ferula- und Sinapsäurenenthalten 3. Phenolsäuren besitzen auch antioxidative Eigenschaften, da sie in der Lage sind, freie Radikale abzufangen, die oxidative Ranzigkeit in Fetten verursachen, und radikalinduzierten oxidativen Stress in physiologischen Systemen zu initiieren und zu verbreiten 4,5. Aufgrund dieser lebenswichtigen physiologischen Rolle als Antioxidantien sind sie Gegenstand neuerer Forschungen. Dies liegt daran, dass sie, wenn sie als Bestandteile pflanzlicher Lebensmittel konsumiert werden, einen antioxidativen Schutz ausüben können.
Getreide und Getreideprodukte sind weltweit wichtige Kohlenhydrat-Nahrungsquellen für Mensch und Tier6. Zu den Getreidearten gehören Weizen, Reis, Mais (Mais), Gerste, Triticale, Hirse und Sorghum. Unter ihnen ist Mais mit einer geschätzten globalen Nutzung von 1.135,7 Millionen Tonnen im Jahr 2019/2020 am meistgenutzten, gefolgt von Weizen mit einer geschätzten globalen Nutzung von 757,5 Millionen Tonnen im gleichen Zeitraum7. Getreideprodukte sind großartige Energiequellen für die Verbraucher, da sie reich an Kohlenhydraten sind. Sie liefern auch etwas Protein, Fett, Ballaststoffe, Vitamine und Mineralien6. Neben ihrem Nährwert sind Getreide gute Quellen für phytochemische Antioxidantien, insbesondere Phenolsäuren, die das physiologische System vor radikalinduzierten oxidativen Schäden schützenkönnen 3. Hülsenfrüchte sind auch gute Nährstoffquellen und haben im Allgemeinen einen höheren Proteingehalt als Getreide. Sie enthalten auch Vitamine und Mineralstoffe und werden bei der Zubereitung verschiedener Lebensmittelverwendet 8. Darüber hinaus sind Hülsenfrüchte gute Quellen für eine Vielzahl von phytochemischen Antioxidantien, einschließlich Phenolsäuren, Flavonoiden, Anthocyanen und Proanthocyanidinen 9,10. Verschiedene Getreidesorten und Hülsenfrüchte können eine unterschiedliche Phenolsäurezusammensetzung aufweisen. Es besteht daher die Notwendigkeit, die Phenolsäurezusammensetzung von Getreide und Hülsenfrüchten und deren Sorten zu untersuchen, um ihre potenziellen gesundheitlichen Vorteile in Bezug auf phenolische Antioxidantien zu kennen.
Es wurde eine Reihe von Assays zur Messung der Menge an Phenolsäuren in Getreide- und Hülsenfrüchtekörnern und zur Bestimmung ihrer antioxidativen Aktivitäten berichtet. Die gebräuchlichsten Analysemethoden für Vollkornphenolsäuren sind die Spektrophotometrie und die Flüssigkeitschromatographie11. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine generalisierte Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiemethode zur Bestimmung der frei löslichen Phenolsäurezusammensetzung und spektralphotometrische Methoden zur Bestimmung des Gesamtphenolgehalts und der antioxidativen Kapazität einiger Vollkorngetreide- und Hülsenfrüchte zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Vollkornprodukte wurden als repräsentative Getreidekörner und Hülsenfrüchte ausgewählt, die weltweit breite Lebensmittelanwendungen finden. Während Variationen zwischen den Sorten jedes Korns bestehen können, lag der Schwerpunkt dieser Studie auf der Demonstration einer verallgemeinerten Methode zur freien Phenolsäureextraktion und -analyse für Vollkornprodukte. Die Extraktionsmethode wurde modifiziert, indem die Mengen an Proben und Lösungsmitteln erheblich reduziert wurden, um die Menge an Chemikalien zu …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Autoren für die technische Unterstützung von Frau Alison Ser und Frau Hannah Oduro-Obeng sowie für die Videobearbeitungsunterstützung durch Frau Janice Fajardo und Herrn Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
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