Окрашивание, визуализация и анализ грибковых, циркумваллятных и нёбных вкусовых рецепторов

Вкусовые рецепторы представляют собой совокупность 50-100 специализированных эпителиальных клеток, которые связывают подмножества химических вкусовых стимулов, присутствующих в ротовой полости. Обычно считается, что вкусопередающие клетки существуют как типы^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,}первоначально основанные на критериях электронной микроскопии, которые позже были коррелированы с молекулярными маркерами. Клетки типа II экспрессируют фосфолипазу C-бета 2 (PLCβ2)² и транзиторный рецепторный потенциал катионного канала, подсемейства M член 5¹ и включают клетки, которые трансдуцируют сладкий, горький и умами^1,10. Клетки iii типа экспрессируют карбоангидразу 4 (Car4)11 и синаптосомально-ассоциированный белок 25⁸ и обозначают клетки, которые в первую очередь реагируют на кислый вкус^11. Клетки, которые передают соленость, не были так четко очерчены^12,13,14,но потенциально могут включать клетки типа I, типа II и типа III^{15,16,17,18,19.} Среда вкусовых рецепторов сложна и динамична, учитывая, что вкусопередающие клетки непрерывно переворачиваются на протяжении всего взрослого возраста и заменяются базальными прародителями^3,20,21. Эти вкусообразующие клетки соединяются с псевдоуниполярными нервными волокнами из геникулятных и петросальных ганглиев, которые передают вкусовую информацию стволу мозга. Эти нейроны в основном были классифицированы на основе типа информации о вкусе, которую они^{несут 22,23, потому} что информация об их морфологии была неуловимой до^{недавнего времени 24.} Клетки типа II сообщаются с нервными волокнами через модулятор гомеостаза кальция 1 ионных каналов^25,тогда как клетки типа III общаются через классические синапсы^8,26. Дальнейшая характеристика клеток вкусовых почек, включая трансдуцирующие линии клеточного типа, факторы, влияющие на их дифференцировку, и структуры соединительных беседок являются областями активного исследования.

Исследования вкусовых рецепторов были затруднены несколькими техническими проблемами. Гетерогенные и плотные ткани, составляющие язык, значительно снижают проницаемость антител для иммуногистохимии^27,28,29. Эти препятствия потребовали протоколов секционирования, которые приводят к расщеплению вкусовых рецепторов по секциям, так что измерения либо аппроксимируются на основе репрезентативных секций, либо суммируются по секциям. Ранее репрезентативные тонкие сечения использовались для аппроксимации как объемных значений, так и количества преобразовательных клеток^30. Более толстое последовательное сечение позволяет получать изображения всех участков вкусовых рецепторов и суммировать измерения из каждой секции^31. Вырезание таких толстых участков и отбор только целых вкусовых рецепторов склоняет выборку в сторону более мелких вкусовых рецепторов^32,33,34. Оценки иннервации нервов из секционированных вкусовых рецепторов были основаны на анализе чисел пикселей^13,35,если количественно оценить их на всех^36,37,38. Эти измерения полностью игнорируют структуру и количество отдельных нервных беседок, потому что беседки расщепляются (и обычно плохо маркируются). Наконец, хотя удаление эпителия позволяет окрашивать целые вкусовые рецепторы^39,40,оно также удаляет нервные волокна вкусовых рецепторов и может нарушить нормальные отношения между клетками. Поэтому исследования структурных отношений во вкусовых рецепторах были ограничены из-за этого нарушения, вызванного подходами окрашивания.

Сбор всей структуры устраняет необходимость в репрезентативных секциях и позволяет определять абсолютные значения измерений объемов, количества клеток и морфологий структуры^41. Этот подход также повышает точность, ограничивает смещение и уменьшает техническую изменчивость. Этот последний элемент важен, потому что вкусовые рецепторы показывают значительную биологическую изменчивость как в пределах^34,42, так и в регионах^43,44,а анализы вкусовых рецепторов позволяют сравнивать абсолютные числа клеток между контрольными и экспериментальными условиями. Кроме того, способность собирать неповрежденные вкусовые рецепторы позволяет анализировать физические отношения между различными трансдуцирующими клетками и связанными с ними нервными волокнами. Поскольку вкусопередающие клетки могут общаться друг с другом⁴⁵ и взаимодействовать с нервными волокнами^46,эти отношения важны для нормальной функции. Таким образом, условия потери функции могут быть вызваны не потерей клеток, а изменениями в клеточных отношениях. Здесь представлен метод сбора целых вкусовых рецепторов для достижения преимуществ абсолютных измерений для уточнения объемных анализов как для вкусовых рецепторов, так и для их иннервации, количества и формы вкусовых клеток, а также для облегчения анализа отношений между трансдуцирующими клетками и морфологии нервно-беседки. Два рабочих процесса также представлены после этого нового метода приготовления тканей: 1) для анализа объема вкусовых рецепторов и общей иннервации и 2) для разреженно-клеточной генетической маркировки вкусовых нейронов (с помеченными подмножествами клеток, преобразующих вкус) и последующего анализа морфологии вкусово-нервных деревьев, количества типов вкусовых клеток и их форм, а также использование программного обеспечения для анализа изображений для анализа физических отношений между трансдуцирующими клетками и между трансдукцией. клетки и их нервные беседки. Вместе эти рабочие процессы обеспечивают новый подход к подготовке тканей и анализу целых вкусовых рецепторов и полной морфологии их иннервирующих беседок.