Colorindo, Visualização e Análise de Papilas de Fungos, Circunvalolados e Paladar

As papilas gustativas são coleções de 50-100 células epiteliais especializadas que ligam subconjuntos de estímulos de gosto químico presentes na cavidade oral. Acredita-se que as células transdutoras de sabor existam como tipos^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}, inicialmente baseadas em critérios de microscopia eletrônica que foram posteriormente correlacionados com marcadores moleculares. As células tipo II expressam fosfolipase C-beta 2 (PLCβ2)² e canal de cação potencial receptor transitório, subfamília M membro 5¹ e incluem células que transduem doce, amargo e umami^1,10. As células tipo III expressam anidragem carbônica 4 (Car4)¹¹ e proteína associada à sinapstosômica 25⁸ e denotam células que respondem principalmente ao sabor azedo¹¹. As células que transduem salgados não foram tão claramente delineadas^12,13,14, mas poderiam potencialmente incluir células tipo I, Tipo II e Tipo III^{15,16,17,18,19}. O ambiente de paladar é complexo e dinâmico, uma vez que as células transdutoras de sabor se transformam continuamente durante toda a idade adulta e são substituídas por progenitores basais^3,20,21. Essas células transdutoras de sabor se conectam a fibras nervosas pseudo-unipolar do gânglio geniculado e petrosal, que passam informações de gosto para o tronco cerebral. Esses neurônios foram categorizados principalmente com base no tipo de informação de sabor que carregam^22,23 porque as informações sobre sua morfologia têm sido evasivas até recentemente²⁴. As células tipo II comunicam-se com fibras nervosas através da proteína moduladora de homeostase de cálcio 1 íon canais²⁵, enquanto as células tipo III se comunicam através de sinapses clássicas^8,26. Maior caracterização das células do paladar – incluindo linhagens do tipo celular transdutor, fatores que influenciam sua diferenciação e as estruturas de arbores de conexão são todas áreas de investigação ativa.

Estudos de paladar têm sido dificultados por vários desafios técnicos. Os tecidos heterogênios e densos que compõem a língua reduzem significativamente a permeabilidade de anticorpos para a imunohistoquímica^27,28,29. Esses obstáculos têm exigido protocolos de secção que resultam na divisão de papilas gustativas entre as seções para que as medidas sejam aproximadas com base em seções representativas ou resumidas em todas as seções. Anteriormente, seções finas representativas têm sido usadas para aproximar os valores de volume e a contagem de células transdutoras³⁰. Seção serial mais espessa permite a imagem de todas as seções de paladar e a soma das medidas de cada seção³¹. Cortando seções tão grossas e selecionando apenas vieses de paladar inteiros amostrando para papilas gustativas menores^32,33,34. As estimativas de inervação nervosa das papilas gustativas seccionadas foram baseadas em análises dos números de^{pixels 13,35}, se quantificadas em todos os^36,37,38. Essas medidas ignoram completamente a estrutura e o número de arbors nervosas individuais, porque as árvores são divididas (e geralmente mal rotuladas). Por fim, embora descascar o epitélio permita que papilas gustativas inteiras sejam manchadas^39,40, ela também remove fibras nervosas gustativas e pode interromper as relações normais entre as células. Portanto, as investigações das relações estruturais dentro das papilas gustativas têm sido limitadas por causa dessa interrupção causada pelas abordagens de coloração.

A coleta de estrutura completa elimina a necessidade de seções representativas e permite a determinação de medições de valor absoluto de volumes, contagem de células e morfologias estruturais⁴¹. Essa abordagem também aumenta a precisão, limita o viés e reduz a variabilidade técnica. Este último elemento é importante porque as papilas gustativas apresentam considerável variabilidade biológica dentro^{de 34,42} e entre as regiões^43,44, e análises de paladar inteiros permitem que números de células absolutas sejam comparados entre o controle e as condições experimentais. Além disso, a capacidade de coletar papilas gustativas intactas permite a análise das relações físicas entre diferentes células transdutoras e suas fibras nervosas associadas. Como as células transdutoras de sabor podem se comunicar entre si⁴⁵ e se comunicar com as fibras nervosas^46,essas relações são importantes para a função normal. Assim, as condições de perda de função podem não ser devido à perda de células, mas sim a mudanças nas relações celulares. Fornecido aqui é um método para coletar papilas gustativas inteiras para obter os benefícios de medidas absolutas para análises de volume de refino tanto para paladar quanto para suas innervações, contagem de células de paladar e formas, e para facilitar análises de relações transdutor-células e morfologias nervosas-arboriológicas. Dois fluxos de trabalho também são apresentados a jusante deste novo método de montagem total para preparação de tecidos: 1) para análise do volume da papila gustativa e inervação total e 2) para rotulagem genética de células esparsas de neurônios de paladar (com subconjuntos de células transdutoras de paladar rotuladas) e análises subsequentes da morfologia da árvore do nervo do paladar, números de tipos de células de sabor e suas formas, e o uso de software de análise de imagem para analisar as relações físicas entre células transdutoras e aquelas entre transdutores células e suas arboris nervosas. Juntos, esses fluxos de trabalho fornecem uma nova abordagem para a preparação de tecidos e para as análises de papilas gustativas inteiras e a morfologia completa de suas arboridades inervas.