Whole-Mount kleuring, visualisatie en analyse van fungiforme, circumvallaat en gehemelte smaakpapillen

Smaakpapillen zijn verzamelingen van 50-100 gespecialiseerde epitheelcellen die subsets van chemische smaakprikkels binden die aanwezig zijn in de mondholte. Smaaktransducerende cellen worden over het algemeen verondersteld te bestaan als typen^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,}aanvankelijk gebaseerd op elektronenmicroscopiecriteria die later werden gecorreleerd met moleculaire markers. Type II-cellen drukken fosfolipase C-beta 2 (PLCβ2)² en transiënte receptorpotentiaal kationkanaal, subfamilie M-lid 5¹ tot expressie en omvatten cellen die zoet, bitter en umami^{transduceren 1,10}. Type III-cellen drukken koolzuuranhydrase 4 (Car4)¹¹ en synaptosomaal geassocieerd eiwit 25⁸ uit en duiden cellen aan die voornamelijk reageren op zure smaak¹¹. De cellen die zoutheid transduceren, zijn niet zo duidelijk afgebakend^12,13,14,maar kunnen mogelijk type I-, type II- en type III-cellen^{15,16,17,18,19}omvatten. De smaakpapillenomgeving is complex en dynamisch, aangezien smaaktransducerende cellen gedurende de volwassenheid voortdurend omdraaien en worden vervangen door basale voorlopers^3,20,21. Deze smaaktransducerende cellen verbinden zich met pseudo-unipolaire zenuwvezels uit de geniculate en petrosale ganglia, die smaakinformatie doorgeven aan de hersenstam. Deze neuronen zijn voornamelijk gecategoriseerd op basis van het soort smaakinformatie dat ze dragen^22,23 omdat informatie over hun morfologie tot voor kort ongrijpbaar was²⁴. Type II-cellen communiceren met zenuwvezels via calciumhomeostasemodulatoreiwit 1 ionkanalen²⁵, terwijl Type III-cellen communiceren via klassieke synapsen^8,26. Verdere karakterisering van smaakpapillencellen, inclusief transducerende celtype-afstammingslijnen, factoren die hun differentiatie beïnvloeden en de structuren van verbindende priëlen zijn allemaal gebieden van actief onderzoek.

Smaakpapillenstudies zijn gehinderd door verschillende technische uitdagingen. De heterogene en dichte weefsels waaruit de tong bestaat, verminderen de antilichaamdoorlaatbaarheid voor immunohistochemie^{aanzienlijk 27,28,29}. Deze obstakels hebben sectieprotocollen noodzakelijk gemaakt die resulteren in het splitsen van smaakpapillen over secties, zodat metingen worden benaderd op basis van representatieve secties of worden opgeteld over secties. Voorheen werden representatieve dunne secties gebruikt om zowel volumewaarden als transducerende celtellingen te benaderen³⁰. Dikkere seriële secties maken de beeldvorming van alle smaakpapillensecties en de som van metingen van elke sectie^{31 mogelijk}. Het snijden van dergelijke dikke secties en het selecteren van alleen hele smaakpapillen vertekent het proeven naar kleinere smaakpapillen^32,33,34. Zenuwinnervatieschattingen van gesegmenteerde smaakpapillen zijn gebaseerd op analyses van pixelgetallen^13,35,indien gekwantificeerd op alle^36,37,38. Deze metingen negeren volledig de structuur en het aantal individuele zenuwprieels, omdat priëlen zijn gesplitst (en meestal slecht gelabeld). Ten slotte, hoewel het epitheel kan worden afgepeld, kunnen hele smaakpapillen worden gekleurd^39,40, het verwijdert ook smaakpapillen zenuwvezels en kan de normale relaties tussen cellen verstoren. Daarom is het onderzoek naar de structurele relaties binnen smaakpapillen beperkt vanwege deze verstoring veroorzaakt door kleuringsbenaderingen.

Verzameling van hele structuren elimineert de noodzaak van representatieve secties en maakt het mogelijk om absolute waardemetingen van volumes, celtellingen en structuurmorfologieën te bepalen⁴¹. Deze aanpak verhoogt ook de nauwkeurigheid, beperkt bias en vermindert technische variabiliteit. Dit laatste element is belangrijk omdat smaakpapillen een aanzienlijke biologische variabiliteit^vertonen,zowel binnen^34,42 als tussen regio’s^43,44,en hele smaakpapillenanalyses maken het mogelijk om absolute celaantallen te vergelijken tussen controle- en experimentele omstandigheden. Bovendien maakt het vermogen om intacte smaakpapillen te verzamelen de analyse van de fysieke relaties tussen verschillende transducerende cellen en hun bijbehorende zenuwvezels mogelijk. Omdat smaaktransducerende cellen met elkaar kunnen communiceren⁴⁵ en communiceren met zenuwvezels⁴⁶, zijn deze relaties belangrijk voor de normale functie. Verlies van functie kan dus niet te wijten zijn aan een verlies van cellen, maar in plaats daarvan aan veranderingen in celrelaties. Hier wordt een methode verstrekt voor het verzamelen van hele smaakpapillen om de voordelen van absolute metingen te bereiken voor het verfijnen van volumeanalyses voor zowel smaakpapillen als hun innervataties, smaakceltellingen en vormen, en voor het vergemakkelijken van analyses van transducerende celrelaties en zenuw-prieelmorfologieën. Twee workflows worden ook gepresenteerd stroomafwaarts van deze nieuwe whole-mount methode voor weefselvoorbereiding: 1) voor het analyseren van smaakpapillenvolume en totale innervatie en 2) voor schaarscellige genetische labeling van smaakneuronen (met subsets van smaaktransducerende cellen gelabeld) en daaropvolgende analyses van smaak-zenuwprieelmorfologie, aantallen smaakceltypen en hun vormen, en het gebruik van beeldanalysesoftware om de fysieke relaties tussen transducerende cellen en die tussen transducerende cellen te analyseren cellen en hun zenuwprieeltjes. Samen bieden deze workflows een nieuwe benadering van weefselvoorbereiding en voor de analyses van hele smaakpapillen en de volledige morfologie van hun innerverende priëlen.