Colorazione, visualizzazione e analisi di papille gustative fungiformi, circumvallate e palato

Le papille gustative sono raccolte di 50-100 cellule epiteliali specializzate che legano sottoinsiemi di stimoli chimico-gustativi presenti nel cavo orale. Si ritiene generalmente che le cellule che trasducono il gusto esistano come tipi^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,}inizialmente sulla base di criteri di microscopia elettronica che sono stati successivamente correlati con marcatori molecolari. Le cellule di tipo II esprimono fosfolipasi C-beta 2 (PLCβ2)² e canale cationico potenziale del recettore transitorio, sottofamiglia M membro^{5 1} e comprendono cellule che trasducono dolce, amaro e umami^1,10. Le cellule di tipo III esprimono anidrasi carbonica 4 (Car4)¹¹ e proteina 25⁸ associata sinaptosomiale e denotano cellule che rispondono principalmente al gusto aspro¹¹. Le cellule che trasducono la salsedine non sono state così chiaramente delineate^12,13,14,ma potrebbero potenzialmente includere le cellule di tipo I, tipo II e III^{15,16,17,18,19.} L’ambiente gustativo è complesso e dinamico, dato che le cellule che trasducono il gusto si trasformano continuamente per tutta l’età adulta e sono sostituite da progenitori basali^3,20,21. Queste cellule che trasducono il gusto si collegano alle fibre nervose pseudo-unipolari dai gangli genicolati e petrosali, che passano le informazioni sul gusto al tronco cerebrale. Questi neuroni sono stati principalmente classificati in base al tipo di informazioni sul gusto che portano^22,23 perché le informazioni sulla loro morfologia sono state sfuggenti fino a poco tempo fa²⁴. Le cellule di tipo II comunicano con le fibre nervose tramite la proteina ionica modulatore dell’omeostasi del calcio^{1 canali ionici 25,}mentre le cellule di tipo III comunicano tramite le sinapsi classiche^8,26. Un’ulteriore caratterizzazione delle cellule delle papille gustative, compresi i lignaggi di tipo cellulare trasduttore, i fattori che influenzano la loro differenziazione e le strutture dei pergole di collegamento sono tutte aree di indagine attiva.

Gli studi sulle papille gustative sono stati ostacolati da diverse sfide tecniche. I tessuti eterogenei e densi che compongono la lingua riducono significativamente la permeabilità anticorpale per l’immunoistochimica^27,28,29. Questi ostacoli hanno reso necessari protocolli di sezionamento che si traducono nella divisione delle papille gustative tra le sezioni in modo che le misurazioni siano approssimate in base a sezioni rappresentative o sommate tra sezioni. In precedenza, le sezioni sottili rappresentative sono state utilizzate per approssimare sia i valori di volume che i conteggi delle celle trasduttori³⁰. Il sezionamento seriale più spesso consente l’imaging di tutte le sezioni di papille gustative e la somma delle misurazioni di ciascuna sezione³¹. Tagliare sezioni così spesse e selezionare solo papille gustative intere distorce il campionamento verso papille gustative più piccole^32,33,34. Le stime di innervazione nervosa delle papille gustative sezionate sono state basate su analisi dei numeri di pixel^13,35,se quantificati in tutto^36,37,38. Queste misurazioni ignorano completamente la struttura e il numero di singoli pergole nervose, perché i pergole sono divisi (e di solito scarsamente etichettati). Infine, sebbene la desquamazione dell’epitelio consenta di macchiare intere papille gustative^39,40,rimuove anche le fibre nervose delle papille gustative e potrebbe interrompere le normali relazioni tra le cellule. Pertanto, le indagini sulle relazioni strutturali all’interno delle papille gustative sono state limitate a causa di questa interruzione causata dagli approcci di colorazione.

La raccolta dell’intera struttura elimina la necessità di sezioni rappresentative e consente la determinazione di misurazioni a valori assoluti di volumi, conteggi cellulari e morfologie della struttura⁴¹. Questo approccio aumenta anche l’accuratezza, limita i pregiudizi e riduce la variabilità tecnica. Quest’ultimo elemento è importante perché le papille gustative mostrano una notevole variabilità biologica sia all’interno^{di 34,42} che tra le regioni^43,44e le analisi delle papille gustative intere consentono di confrontare i numeri assoluti delle cellule tra condizioni di controllo e sperimentali. Inoltre, la capacità di raccogliere papille gustative intatte consente l’analisi delle relazioni fisiche tra le diverse cellule trasducenti e le fibre nervose associate. Poiché le cellule che trasducono il gusto possono comunicare tra loro⁴⁵ e comunicare con le fibre nervose⁴⁶, queste relazioni sono importanti per la normale funzione. Pertanto, le condizioni di perdita di funzione potrebbero non essere dovute a una perdita di cellule, ma piuttosto a cambiamenti nelle relazioni cellulari. Qui è fornito un metodo per raccogliere intere papille gustative per ottenere i benefici delle misurazioni assolute per perfezionare le analisi del volume sia per le papille gustative che per le loro innervazioni, i conteggi e le forme delle cellule gustative e per facilitare le analisi delle relazioni trasduttore-cellula e delle morfologie nervo-pergolato. Due flussi di lavoro sono anche presentati a valle di questo nuovo metodo a monte intero per la preparazione dei tessuti: 1) per l’analisi del volume delle papille gustative e dell’innervazione totale e 2) per l’etichettatura genetica a cellule sparse dei neuroni del gusto (con sottoinsiemi di cellule che trasducono il gusto etichettate) e successive analisi della morfologia del pergolato del nervo del gusto, del numero di tipi di cellule del gusto e delle loro forme e l’uso di software di analisi delle immagini per analizzare le relazioni fisiche tra le cellule trasducenti e quelle trasduttori cellule e i loro pergole nervose. Insieme, questi flussi di lavoro forniscono un nuovo approccio alla preparazione dei tessuti e per l’analisi di intere papille gustative e la morfologia completa dei loro pergole innervanti.