Färbung, Visualisierung und Analyse von Fungiform-, Circumvallate- und Gaumengeschmacksknospen

Geschmacksknospen sind Ansammlungen von 50-100 spezialisierten Epithelzellen, die Untergruppen von chemischen Geschmacksreizen in der Mundhöhle binden. Geschmackstransduzierende Zellen werden allgemein als Typen 1,^2,3,4,5,^6,7,8,9angesehen, zunächst basierend auf elektronenmikroskopischen Kriterien, die später mit molekularen Markern korreliert wurden. Typ-II-Zellen exprimieren Phospholipase C-beta 2 (PLCβ2)² und transienten Rezeptorpotential-Kationenkanal, Unterfamilie M-Mitglied^{5 1} und umfassen Zellen, die süß, bitter und Umami transduzieren^1,10. Typ-III-Zellen exprimieren Carboanhydrase 4 (Car4)¹¹ und synaptosomal-assoziiertes Protein^{25 8} und bezeichnen Zellen, die primär auf sauren Geschmack reagieren¹¹. Die Zellen, die Salzigkeit transduzieren, wurden nicht so klar abgegrenzt^12,13,14, könnten aber möglicherweise Typ I, Typ II und Typ III Zellen^{15,16,17,18,19}umfassen. Die Geschmacksknospenumgebung ist komplex und dynamisch, da sich geschmackstransduzierende Zellen während des gesamten Erwachsenenalters kontinuierlich umdrehen und durch basale Vorläufer^3,20,21ersetzt werden. Diese geschmackstransduzierenden Zellen verbinden sich mit pseudo-unipolaren Nervenfasern aus den genikulären und petrosalen Ganglien, die Geschmacksinformationen an den Hirnstamm weitergeben. Diese Neuronen wurden in erster Linie auf der Grundlage der Art von Geschmacksinformationen^{kategorisiert,}die sie tragen²²,^23, weil Informationen über ihre Morphologie bis vor kurzem schwer fassbar waren²⁴. Typ-II-Zellen kommunizieren mit Nervenfasern über Calcium-Homöostase-Modulator-Protein 1 Ionenkanäle^25,während Typ-III-Zellen über klassische Synapsen^8,26kommunizieren. Die weitere Charakterisierung von Geschmacksknospenzellen – einschließlich transduzierender Zelltyplinien, Faktoren, die ihre Differenzierung beeinflussen, und der Strukturen von Verbindungslauben sind alle Bereiche der aktiven Untersuchung.

Geschmacksknospenstudien wurden durch mehrere technische Herausforderungen behindert. Die heterogenen und dichten Gewebe, aus denen die Zunge besteht, reduzieren die Antikörperdurchlässigkeit für die Immunhistochemie signifikant^27,28,29. Diese Hindernisse haben Schnittprotokolle erforderlich gemacht, die zur Aufteilung der Geschmacksknospen auf Abschnitte führen, so dass die Messungen entweder auf der Grundlage repräsentativer Abschnitte angenähert oder über Abschnitte hinweg summiert werden. Bisher wurden repräsentative Dünnschliffe verwendet, um sowohl Volumenwerte als auch transduzierende Zellzahlen³⁰zu approximieren. Dickere serielle Schnitte ermöglichen die Abbildung aller Geschmacksknospenabschnitte und die Summierung der Messungen aus jeder Sektion³¹. Das Schneiden solcher dicken Abschnitte und die Auswahl nur ganzer Geschmacksknospen verzerrt die Probenahme zu kleineren Geschmacksknospen^32,33,34. Nerveninnervationsschätzungen aus geschnittenen Geschmacksknospen basieren auf Analysen der Pixelzahlen^13,35, wenn überhaupt quantifiziert^36,37,38. Diese Messungen ignorieren die Struktur und Anzahl der einzelnen Nervenlauben vollständig, da Die Dorne gespalten (und in der Regel schlecht beschriftet) sind. Schließlich, obwohl das Abziehen des Epithels es ermöglicht, ganze Geschmacksknospen zu^{färben 39,40}, entfernt es auch Geschmacksknospennervenfasern und könnte die normalen Beziehungen zwischen den Zellen stören. Daher waren untersuchungen der strukturellen Beziehungen innerhalb der Geschmacksknospen aufgrund dieser störung durch färbende Ansätze begrenzt.

Die Gesamtstruktursammlung macht repräsentative Abschnitte überflüssig und ermöglicht die Bestimmung von Absolutwertmessungen von Volumen, Zellzahlen und Strukturmorphologien⁴¹. Dieser Ansatz erhöht auch die Genauigkeit, begrenzt Verzerrungen und reduziert die technische Variabilität. Dieses letzte Element ist wichtig, da Die Geschmacksknospen sowohl innerhalb von^34,42 als auch über die Regionen^43,44hinweg eine beträchtliche biologische Variabilität aufweisen und Analysen des gesamten Geschmacksknospen es ermöglichen, absolute Zellzahlen zwischen Kontroll- und Versuchsbedingungen zu vergleichen. Darüber hinaus erlaubt die Fähigkeit, intakte Geschmacksknospen zu sammeln, die Analyse der physikalischen Beziehungen zwischen verschiedenen transduzierenden Zellen und den damit verbundenen Nervenfasern. Da geschmackstransduzierende Zellen miteinander kommunizieren können⁴⁵ und mit Nervenfasern^{kommunizieren 46}, sind diese Beziehungen wichtig für die normale Funktion. Daher können Funktionsverlustbedingungen nicht auf einen Verlust von Zellen zurückzuführen sein, sondern auf Veränderungen in den Zellbeziehungen. Hier ist eine Methode zum Sammeln ganzer Geschmacksknospen vorgesehen, um die Vorteile absoluter Messungen zur Verfeinerung von Volumenanalysen sowohl für Geschmacksknospen als auch für ihre Innervationen, Geschmackszellzahlen und -formen sowie zur Erleichterung der Analyse von transduzierenden Zellbeziehungen und Nerven-Dorn-Morphologien zu erreichen. Zwei Workflows werden auch nach dieser neuartigen Whole-Mount-Methode zur Gewebevorbereitung vorgestellt: 1) zur Analyse des Geschmacksknospenvolumens und der Gesamtinnervation und 2) zur spärlichen zellgenegenten genetischen Markierung von Geschmacksneuronen (mit Untergruppen von geschmackstransduzierenden Zellen) und anschließenden Analysen der Geschmacksnervenbaummorphologie, der Anzahl der Geschmackszelltypen und ihrer Formen sowie der Verwendung von Bildanalysesoftware zur Analyse der physikalischen Beziehungen zwischen transduzierenden Zellen und denen zwischen transduzierenden Zellen Zellen und ihre Nervenlauben. Zusammen bieten diese Arbeitsabläufe einen neuartigen Ansatz zur Gewebevorbereitung und für die Analyse ganzer Geschmacksknospen und der vollständigen Morphologie ihrer innervierenden Dorne.