Mantar Formu, Sirkülasyon ve Damak Tat Tomurcuklarının Bütün Montajlı Boyama, Görselleştirme ve Analizi

Tat tomurcukları, ağız boşluğunda bulunan kimyasal tat uyaranlarının alt kümelerini bağlayan 50-100 özel epitel hücresinin koleksiyonlarıdır. Tat dönüştürücü hücrelerin genellikle tip¹, 2 ,^3,4,5,6,7^,8,9, başlangıçta daha sonra moleküler belirteçlerle ilişkili elektron mikroskopi kriterlerine dayanarak var olduğu düşünülmektedir. Tip II hücreleri fosfolipaz C-beta 2 (PLCβ2)² ve geçici reseptör potansiyel katyon kanalını, M üyesi^{5 1} alt familyalarını ifade etmekte ve tatlı, acı ve umami 1^,10’utransdüse eden hücreleri içerir. Tip III hücreler karbonik anhidraz 4 (Car4)¹¹ ve sinaptozomal ilişkili protein 25^8’i ifade eder ve öncelikle ekşi tada yanıt veren hücreleri gösterir¹¹. Tuzluluğu transdüse eden hücreler^{12 , 13,14}kadar net bir şekilde tanımlanmış değildir, ancak Potansiyel olarak Tip I, Tip II ve Tip III hücreleri^{15 , 16,17,18,19}içerebilir. Tat alma tomurcuk ortamı karmaşık ve dinamiktir, tat dönüştürücü hücrelerin yetişkinlik boyunca sürekli olarak ters dönmesi ve yerini bazal ataların³,^20,21′e bırakmalarıdır. Bu tat dönüştürücü hücreler, beyin sapına tat bilgisi ileten genikül ve petrosal gangliyonlardan gelen sözde tek kutuplu sinir liflerine bağlanır. Bu nöronlar öncelikle taşıdıkları tat bilgilerine göre kategorize edilmiştir^22,23 çünkü morfolojileri hakkındaki bilgiler yakın zamana kadar^{zor 24}. Tip II hücreleri kalsiyum homeostaz modülatörü proteini 1 iyon kanalları²⁵aracılığıyla sinir lifleri ile iletişim kurarken, Tip III hücreleri klasik sinapslar aracılığıyla iletişim kurar^8,26. Transdükleme hücre tipi soyları, farklılaşmalarını etkileyen faktörler ve çardakların bağlanma yapıları dahil olmak üzere tat tomurcuk hücrelerinin daha fazla karakterizasyonu aktif araştırma alanlarıdır.

Tat alma tomurcukları çalışmaları çeşitli teknik zorluklarla engellenmiştir. Dili oluşturan heterojen ve yoğun dokular immünhistokimya için antikor geçirgenliğini önemli ölçüde azaltır^27,28,29. Bu engeller, tat tomurcuklarının bölümler arasında bölünmesiyle sonuçlanan bölümleme protokollerini gerektirdi, böylece ölçümler temsili bölümlere göre yaklaşık olarak veya bölümler arasında toplanır. Daha önce, hem hacim değerlerini hem de dönüştürücü hücre sayılarını^30’ayaklaşık olarak görmek için temsili ince bölümler kullanılmıştır. Daha kalın seri kesitleme, tüm tat alma bölümlerinin görüntülenmesini ve her bölümdeki ölçümlerin toplanmış olmasını sağlar^31. Bu tür kalın bölümlerin kesilmesi ve sadece bütün tat tomurcuklarının seçilmesi, daha küçük tat tomurcuklarına doğru örnekleme^{önyargıları 32,33,34}. Kesitli tat tomurcuklarından gelen sinir innervasyon^{tahminleri,36 , 37},³⁸‘in tamamında ölçülürse,^13,35piksel numaralarının analizlerine dayanmaktadır. Bu ölçümler, tek tek sinir çardaklarının yapısını ve sayısını tamamen göz ardı eder, çünkü çardaklar bölünür (ve genellikle kötü etiketlenir). Son olarak, epitelin soyulması tüm tat tomurcuklarının lekeli olmasına izin verse de^39,40, ayrıca tat tomurcuk sinir liflerini de giderir ve hücreler arasındaki normal ilişkileri bozabilir. Bu nedenle, lekeleme yaklaşımlarının neden olduğu bu bozulma nedeniyle tat tomurcukları içindeki yapısal ilişkilerin araştırılması sınırlanmıştır.

Tüm yapı koleksiyonu temsili bölümlere olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve hacimlerin, hücre sayımlarının ve yapı morfolojilerinin mutlak değer ölçümlerinin belirlenmesine izin verir⁴¹. Bu yaklaşım aynı zamanda doğruluğu artırır, önyargıyı sınırlar ve teknik değişkenliği azaltır. Bu son element önemlidir, çünkü tat tomurcukları hem^{34 , 42}hem de^{43 ,44}bölgelerinde önemli biyolojik değişkenlik gösterir ve tüm tat alma tomurcukları analizleri mutlak hücre sayılarının kontrol ve deneysel koşullar arasında karşılaştırılmasını sağlar. Ayrıca, bozulmamış tat tomurcuklarını toplama yeteneği, farklı transdüksiyon hücreleri ve ilişkili sinir lifleri arasındaki fiziksel ilişkilerin analizine izin sağlar. Çünkü tat dönüştürücü hücreler birbirleriyle iletişim kurabilir⁴⁵ ve sinir lifleri ile iletişim kurabilir⁴⁶Bu ilişkiler normal fonksiyon için önemlidir. Bu nedenle, işlev kaybı koşulları hücre kaybından değil, hücre ilişkilerindeki değişikliklerden kaynaklanabilir. Burada, hem tat tomurcukları hem de içsellikleri, tat hücresi sayıları ve şekilleri için hacim analizlerini iyileştirmek ve dönüştürücü hücre ilişkilerinin ve sinir-çardak morfolojilerinin analizlerini kolaylaştırmak için mutlak ölçümlerin faydalarını elde etmek için bütün tat tomurcuklarını toplamak için bir yöntem verilmiştir. Doku hazırlama için bu yeni tam montaj yönteminin aşağı doğru iki iş akışı da sunulmaktadır: 1) tat tomurcuk hacmini ve toplam innervasyonu analiz etmek için ve 2) tat nöronlarının seyrek hücreli genetik etiketlemesi için (tat dönüştürücü hücrelerin alt kümeleri etiketli) ve daha sonra tat-sinir çardak morfolojisinin analizleri, tat hücresi türlerinin ve şekillerinin sayısı ve transdükleyici hücreler ile transdüksiyon arasındaki fiziksel ilişkileri analiz etmek için görüntü analizi yazılımının kullanılması hücreler ve sinir çardakları. Birlikte, bu iş akışları doku hazırlamaya ve tüm tat tomurcuklarının analizlerine ve içsel çardaklarının tam morfolojisine yeni bir yaklaşım sağlar.