Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado

La mucosa intestinal abarca una sola capa de células epiteliales intestinales columnares (IECs), las células inmunes subyacentes del propria de la lámina y las mucosas de los muscularis. Además de su papel en la absorción de nutrientes, el epitelio intestinal es una barrera física que protege el interior del cuerpo de las bacterias comensales luminales, patógenos y antígenos dietéticos. Además, los IECs y las células inmunes de la lámina propia coordinan la inmunorespuesta que induce tolerancia o respuesta dependiendo del contexto y de los estímulos. Se ha divulgado que la interrupción de la barrera epitelial puede preceder el inicio de la inflamación de la mucosa patológica y contribuir a la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) que abarca colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn^{1,2,3,4,5,6,7.} Los individuos con colitis ulcerosa presentan migración transepitelial excesiva (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) formando abscesos de cripta, hallazgo que se ha asociado con la gravedad de la enfermedad^8,9. Aunque la función epitelial comprometida de la barrera y las inmunorespuestas excesivas sean sellos de IBD, hay una carencia de análisis in vivo experimentales para realizar evaluaciones cuantitativas de la permeabilidad intestinal y del reclutamiento de la célula inmune en la mucosa intestinal.

Los métodos más comunes utilizados para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal y PMN TEpM emplean enfoques basados en cámaras ex vivo utilizando monocapas IEC cultivadas en insertos de membrana porosa semipermeables^10,11,12. La integridad de la barrera epitelial es supervisada por mediciones de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) o el flujo paracelular del isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano marcado desde el compartimento apical al basal^13,14,15. Del mismo modo, pmn TEpM se estudia típicamente en respuesta a un quimioatrayente que se añade en la cámara baja¹⁶. Los PMN se colocan en la cámara superior y después de un período de incubación, los PMN que han migrado al compartimento basal se recogen y cuantifican. Si bien estos métodos son útiles, fáciles de realizar y muy reproducibles, son obviamente enfoques reduccionistas y no necesariamente representan un reflejo preciso de las condiciones in vivo.

En ratones, un ensayo común para estudiar la permeabilidad paracelular intestinal es por sonda oral de FITC-dextrano y posterior medición de la aparición de FITC-dextrano en el suero sanguíneo^13,17. La desventaja de este análisis es que representa una evaluación de la integridad total de la barrera del aparato gastrointestinal bastante que la de contribuciones intestinales regionales. Además, el azul de Evans se utiliza comúnmente para evaluar la fuga vascular in vivo¹⁸ y también se ha empleado para evaluar la permeabilidad de la mucosa intestinal en ratones y ratas^19,20,21. La cuantificación del azul de Evans en la mucosa intestinal requiere la extracción del tejido que emplea la incubación en formamida durante la noche. Por lo tanto, el mismo tejido no se puede utilizar para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal y la infiltración de neutrófilos.

Aquí destacamos un protocolo simple que reduce el número de animales necesarios para recoger datos reproducibles sobre la permeabilidad de la mucosa colónica y la migración transepitelial leucocito in vivo. Por lo tanto, recomendamos el uso de FITC-dextrans que son fácilmente perceptibles en suero sanguíneo sin comprometer la integridad de los lazos intestinales que se pueden cosechar para el análisis adicional. Cabe destacar que los bucles ligados intestinales se han utilizado en varias especies (incluyendo ratón, rata, conejo, ternero) para estudiar la infección bacteriana (como Salmonella, Listeria monocytogenes y Escherichia coli)^22,23,24,25, así como la permeabilidad intestinal^26; sin embargo, al mejor de nuestro conocimiento no hay estudios que investigan mecanismos de PMN TEpM en regiones específicas en el intestino tal como íleo o dos puntos que están implicados comúnmente en IBD.

Aquí describimos el modelo del lazo intestinal del ratón (iLoop) que es un método in vivo microquirúrgico robusto y confiable que emplea un segmento intestinal bien-vascularizado y exteriorizado del íleon o de los dos puntos próximos. El modelo iLoop es fisiológicamente relevante y permite la evaluación de la integridad de la barrera intestinal y pmn TEpM en ratones vivos bajo anestesia. Demostramos dos aplicaciones: 1) cuantificación de los niveles séricos de 4 kDa FITC-dextrano después de la administración intraluminal en el iLoop 2) cuantificación de PMN transmigrado en el lumen iLoop después de la inyección intraluminal del potente quimiotractor Leucotrieno B₄ (LTB₄₎^27. Por otra parte, la utilización del modelo iLoop con Jam-a-null ratones o ratones que albergan la pérdida selectiva de JAM-A en IECs (Villin-cre; Jam-a ^fl/fl)en comparación con los ratones control, podemos corroborar estudios previos que han reportado una importante contribución de la proteína jam-A asociada a la unión apretada a la permeabilidad intestinal y la transmigración de neutrófilos^{15,28,29,30,31.}

El modelo iLoop es un método altamente funcional y fisiológico que se puede utilizar para corroborar ensayos in vitro. Además, se trata de un modelo experimental versátil que permite el estudio de diversos reactivos que se pueden inyectar en la luz del asa, incluyendo quimiocinas, citoquinas, patógenos bacterianos, toxinas, anticuerpos y terapéuticas.