Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

La muqueuse intestinale englobe une seule couche de cellules épithéliales intestinales conaires (CSI), les cellules immunitaires sous-jacentes de propria de lame et les muqueuses musculaires. Outre son rôle dans l’absorption des nutriments, l’épithélium intestinal est une barrière physique qui protège l’intérieur du corps contre les bactéries commensales luminales, les agents pathogènes et les antigènes alimentaires. En outre, les cellules immunitaires IECs et propria de lame coordonnent la réponse immunitaire induisant la tolérance ou la réponse selon le contexte et les stimuli. Il a été rapporté que la perturbation de la barrière épithéliale peut précéder l’apparition de l’inflammation muqueuse pathologique et contribuer à la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) englobant à la fois la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn^{1,2,3,4,5,6,7.} Les individus atteints de colite ulcéreuse présentent une migration transépithéliale excessive (TEpM) de neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) formant des abcès de crypte, une conclusion qui a été associée à la gravité de la maladie^8,9. Bien que la fonction compromise de barrière épithéliale et les immuno-réactions excessives soient des caractéristiques de IBD, il y a un manque d’essais in vivo expérimentaux pour exécuter des évaluations quantitatives de la perméabilité intestinale et du recrutement de cellules immunitaires dans la muqueuse intestinale.

Les méthodes les plus couramment utilisées pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et pmn TEpM emploient des approches ex vivo à base de chambre utilisant des monocouches IEC cultivées sur des inserts de membrane poreuse semi-perméables^10,11,12. L’intégrité de la barrière épithéliale est surveillée soit par des mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER), soit par le flux paracellulaire du dextrane marqué par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) du compartiment apical au compartiment basal^13,14,15. De même, le PMN TEpM est typiquement étudié en réponse à un chimioattractant qui est ajouté dans la chambre basse^16. Les PMN sont placés dans la chambre haute et après une période d’incubation, les PMN qui ont migré dans le compartiment basal sont collectés et quantifiés. Bien que ces méthodes soient utiles, faciles à réaliser et très reproductibles, elles sont évidemment des approches réductionnistes et ne représentent pas nécessairement un reflet précis des conditions in vivo.

Chez la souris, un dosage courant pour étudier la perméabilité paracellulaire intestinale consiste à gavage oral de FITC-dextrane et mesure ultérieure de l’aspect FITC-dextrane dans le sérum sanguin^13,17. L’inconvénient de ce test est qu’il représente une évaluation de l’intégrité globale de la barrière du tractus gastro-intestinal plutôt que celle des contributions intestinales régionales. En outre, le bleu d’Evans est couramment utilisé pour évaluer les fuites vasculaires in vivo¹⁸ et a également été utilisé pour évaluer la perméabilité muqueuse intestinale chez la souris et le rat^19,20,21. La quantification du bleu d’Evans dans la muqueuse intestinale nécessite une extraction à partir de tissus utilisant l’incubation dans le formamide pendant la nuit. Par conséquent, le même tissu ne peut pas être employé pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et l’infiltration de neutrophile.

Ici nous mettons en évidence un protocole simple qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour collecter des données reproductibles sur la perméabilité muqueuse du côlon et la migration transepithelial de leucocyte in vivo. Nous recommandons donc l’utilisation de FITC-dextrans qui sont facilement discernables dans le sérum sanguin sans compromettre l’intégrité des boucles intestinales qui peuvent être récoltées pour davantage d’analyse. A noter, les boucles ligatures intestinales ont été utilisées chez diverses espèces (dont la souris, le rat, le lapin, le veau) pour étudier les infections bactériennes (telles que Salmonella, Listeria monocytogenes et Escherichiacoli)22,^23,24,25 ainsi que la perméabilité intestinale²⁶; cependant, au meilleur de notre connaissance il n’y a aucune étude étudiant des mécanismes de PMN TEpM dans des régions spécifiques dans l’intestin telles que l’iléon ou les deux points qui sont généralement impliqués dans IBD.

Ici nous décrivons le modèle intestinal de boucle intestinale de souris (iLoop) qui est une méthode in vivo microchirurgical robuste et fiable qui emploie un segment intestinal bien-vascularisé et extériorisé de l’iléon ou des deux points proximaux. Le modèle iLoop est physiologiquement pertinent et permet d’évaluer l’intégrité de la barrière intestinale et le PMN TEpM sur des souris vivantes sous anesthésie. Nous démontrons deux applications : 1) quantification des niveaux sériques de 4 kDa FITC-dextrane après administration intraluminale dans l’iLoop 2) quantification de PMN transmigré dans l’iLoop lumen après injection intraluminale du puissant chemottractant Leukotriene_B4 (LTB₄₎^27. De plus, en utilisant le modèle iLoop avec des souris Jam-a-nullou des souris hébergeant une perte sélective de JAM-A sur les IECs (Villin-cre; Jam-a ^fl/fl)par rapport aux souris témoins, nous sommes en mesure de corroborer des études antérieures qui ont rapporté une contribution majeure pour la protéine JAM-A associée à la jonction serrée à la perméabilité intestinale et à la transmigration des neutrophiles^{15,28,29,30,31.}

Le modèle iLoop est une méthode hautement fonctionnelle et physiologique qui peut être utilisée pour corroborer les essais in vitro. En outre, il s’agit d’un modèle expérimental polyvalent qui permet l’étude de divers réactifs qui peuvent être injectés dans la lumière de l’anse, y compris les chimiokines, les cytokines, les agents pathogènes bactériens, les toxines, les anticorps et les thérapeutiques.