Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale

La mucosa intestinale comprende un singolo strato di cellule epiteliali intestinali colonnari (IHC), cellule immunitarie lamina propria sottostanti e mucose muscolose. Oltre al suo ruolo nell’assorbimento dei nutrienti, l’epitelio intestinale è una barriera fisica che protegge l’interno del corpo da batteri commensali luminali, agenti patogeni e antigeni dietetici. Inoltre, IEC e le cellule immunitarie lamina propria coordinano la risposta immunitaria inducendo tolleranza o risposta a seconda del contesto e degli stimoli. È stato riferito che l’interruzione della barriera epiteliale può precedere l’insorgenza di infiammazione della mucosa patologica e contribuire alla malattia infiammatoria intestinale (IBD) che comprende sia la colite ulcerosa che la malattia di Crohn^{1,2,3,4,5,6,7}. Gli individui con colite ulcerosa presentano un’eccessiva migrazione transepiteliale (TEpM) dei neutrofili polimorfonucleari (PMN) che formano ascessi di cripta, una scoperta che è stata associata alla gravità^{della malattia 8,9}. Sebbene la funzione di barriera epiteliale compromessa e le risposte immunitarie eccessive siano segni distintivi dell’IBD, mancano test sperimentali in vivo per eseguire valutazioni quantitative della permeabilità intestinale e del reclutamento delle cellule immunitarie nella mucosa intestinale.

I metodi più comuni utilizzati per studiare la permeabilità epiteliale intestinale e il PMN TEpM utilizzano approcci a camera ex vivo utilizzando monostrati IEC coltivati su inserti di membrana porosa semi-permeabile^10,11,12. L’integrità della barriera epiteliale è monitorata da misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) o del flusso paracellulare dell’isotiocianato di fluoresceina (FITC) etichettato dextran dal compartimento apicale a quello basale^13,14,15. Allo stesso modo, il PMN TEpM viene in genere studiato in risposta a un chemioattrattante che viene aggiunto nella camera inferiore¹⁶. Le PMN vengono poste nella camera superiore e dopo un periodo di incubazione, le PMN che sono migrate nel compartimento basale vengono raccolte e quantificate. Sebbene questi metodi siano utili, facili da eseguire e molto riproducibili, sono ovviamente approcci riduzionisti e non rappresentano necessariamente un riflesso accurato delle condizioni in vivo.

Nei topi, un saggio comune per studiare la permeabilità paracellulare intestinale è per gavage orale di FITC-dextran e successiva misurazione dell’aspetto FITC-dextran nel siero del sangue^13,17. Lo svantaggio di questo saggio è che rappresenta una valutazione dell’integrità complessiva della barriera del tratto gastrointestinale piuttosto che quella dei contributi intestinali regionali. Inoltre, evans blue è comunemente usato per valutare la perdita vascolare in vivo^{18 ed} è stato anche impiegato per valutare la permeabilità della mucosa intestinale nel topo^{e nel ratto 19,20,21}. La quantificazione del blu Evans nella mucosa intestinale richiede l’estrazione dal tessuto impiegando incubazione in formamide durante la notte. Pertanto, lo stesso tessuto non può essere utilizzato per studiare la permeabilità epiteliale intestinale e l’infiltrazione di neutrofili.

Qui evidenziamo un semplice protocollo che riduce il numero di animali necessari per raccogliere dati riproducibili sulla permeabilità della mucosa colonica e sulla migrazione transepiteliale dei leucociti in vivo. Raccomandiamo pertanto l’uso di FITC-dextrans facilmente rilevabili nel siero del sangue senza compromettere l’integrità dei loop intestinali che possono essere raccolti per ulteriori analisi. Da notare che gli anelli legati intestinali sono stati utilizzati in varie specie (tra cui topo, ratto, coniglio, vitello) per studiare l’infezione batterica (come Salmonella, Listeria monocytogenes ed Escherichia coli)^22,23,24,^25, nonché la permeabilità intestinale^26; tuttavia, per quanto ne so non ci sono studi che studiano meccanismi di PMN TEpM in regioni specifiche nell’intestino come l’ileo o il colon che sono comunemente coinvolti nell’IBD.

Qui descriviamo il modello dell’anello intestinale del topo (iLoop) che è un metodo in vivo microchirurgico robusto e affidabile che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore del colon ileo o prossimale. Il modello iLoop è fisiologicamente rilevante e consente la valutazione dell’integrità della barriera intestinale e del TEpM PMN sui topi viventi in anestesia. Dimostriamo due applicazioni: 1) quantificazione dei livelli sieri di 4 kDa FITC-dextran dopo somministrazione intraluminale nell’iLoop 2) quantificazione della PMN trasmigrata nel lume iLoop dopo iniezione intraluminale della potente chemiotractant Leukotriene B₄ (LTB₄)²⁷. Inoltre, utilizzando il modello iLoop con topi o topi Jam-a-null che ospitano una perdita selettiva di JAM-A sugli IEC(Villin-cre; Jam-a ^fl/fl) rispetto ai topi di controllo, siamo in grado di confermare studi precedenti che hanno riportato un importante contributo per la proteina JAM-A associata alla giunzione stretta alla permeabilità intestinale e alla trasmigrazione neutrofila^{15,28,29,30,31}.

Il modello iLoop è un metodo altamente funzionale e fisiologico che può essere utilizzato per confermare saggi in vitro. Inoltre, questo è un modello sperimentale versatile che consente lo studio di vari reagenti che possono essere iniettati nel lume loop, tra cui chemiochine, citochine, agenti patogeni batterici, tossine, anticorpi e terapie.