הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת
Summary
תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.
Abstract
רירית המעי מרופד בשכבה אחת של תאי אפיתל היוצרת מחסום דינמי המאפשר הובלה paracellular של חומרים מזינים ומים תוך מניעת מעבר של חיידקים זוהרים וחומרים אקסוגניים. הפרה של שכבה זו גורמת לחמיצות מוגברת לתכולה זוהרת וגיוס של תאי מערכת החיסון, שניהם סימני היכר של מצבים פתולוגיים במעיים כולל מחלות מעי דלקתיות (IBD).
מנגנונים המסדירים את תפקוד מחסום האפיתל ואת ההגירה הטרנס-אפיתלית (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקלאריים (PMN) אינם מובנים לחלוטין בשל היעדר שיטות ניסיוניות ב- vivo המאפשרות ניתוחים כמותיים. כאן, אנו מתארים מודל ניסיוני מורין חזק המעסיק קטע מעיים חיצוני של ileum או המעי הגס הפרוקסימלי. לולאת המעי החיצונית (iLoop) היא בעלת כלי דם מלאים ומציעה יתרונות פיזיולוגיים על פני גישות מבוססות תא ex vivo המשמשות בדרך כלל לחקר חלחנות ונדידת PMN על פני מונולי תאים אפיתל.
אנו מדגימים שני יישומים של מודל זה בפירוט: (1) מדידה כמותית של חמיטות מעיים באמצעות זיהוי של dextrans תווית פלואורסצנטיות בסרום לאחר הזרקה תוך אלומינלית, (2) הערכה כמותית של PMN נודד על פני אפיתל המעי לתוך לומן המעיים לאחר הקדמה תוך-אלומינלית של כימותרפיה. אנו מדגימים היתכנות של מודל זה ומספקים תוצאות המשתמשות ב- iLoop בעכברים חסר חלבון הקשור לאפיתל הדוק צומת JAM-A בהשוואה לבקרות. JAM-A הוכח לווסת את תפקוד מחסום האפיתל, כמו גם PMN TEpM במהלך תגובות דלקתיות. התוצאות שלנו באמצעות iLoop לאשר מחקרים קודמים ולהדגיש את החשיבות של JAM-A בוויסות של חדירות מעיים PMN TEpM ב vivo במהלך הומאוסטזיס ומחלות.
מודל iLoop מספק שיטה סטנדרטית מאוד לשחזור במחקרי vivo של הומאוסטזיס מעיים ודלקת וישפר באופן משמעותי את ההבנה של תפקוד מחסום המעי ודלקת ריריים במחלות כגון IBD.
Introduction
רירית המעי מקיפה שכבה אחת של תאי אפיתל מעיים טוריים (IECs), תאי מערכת החיסון הבסיסיים של למינה פרופריה וריריות השרירים. מלבד תפקידו בספיגת חומרים מזינים, אפיתל המעי הוא מחסום פיזי המגן על פנים הגוף מפני חיידקים קומנסליים זוהרים, פתוגנים ואנטיגנים תזונתיים. בנוסף, IECs ותאי חיסון lamina propria לתאם את התגובה החיסונית גרימת סובלנות או תגובה בהתאם להקשר וגירויים. דווח כי ההפרעה של מחסום האפיתל יכולה להקדים את תחילת דלקת רירית פתולוגית ולתרום למחלות מעי דלקתיות (IBD) המקיפה הן קוליטיס כיבית והן מחלת קרוהן1,2,3,4,5,6,7. אנשים עם קוליטיס כיבית מציגים הגירה טרנס-אפיתלאלית מוגזמת (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקלאריים (PMN) היוצרים מורסות קריפטה, ממצא שנקשר לחומרת המחלה8,9. למרות תפקוד מחסום אפיתל נפגע ותגובות חיסוניות מוגזמות הם סימני היכר של IBD, יש חוסר ניסיוני בדיקות vivo לבצע הערכות כמותיות של חדורות מעיים וגיוס תאי החיסון לתוך רירית המעי.
השיטות הנפוצות ביותר המשמשות לחקר חדירות אפיתל מעיים ו- PMN TEpM משתמשות בגישות מבוססות תא ex vivo באמצעות monolayers של חברת החשמל המתרבתים על קרום נקבובי חדיר למחצה מוסיף10,11,12. שלמות מחסום האפיתל מנוטרת על ידי מדידות של התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER) או השטף הפאראלי של האיזוטיווציאנאט פלואורסצין (FITC) המסומן על ידי דקסטרן מתא apical לסל13,14,15. באופן דומה, PMN TEpM נחקר בדרך כלל בתגובה כימותרפיה כי הוא הוסיף בתא התחתון16. PMN ממוקמים בתא העליון ולאחר תקופת דגירה, PMN כי היגרו לתוך התא בזאלי נאספים וכימות. בעוד שיטות אלה שימושיות, קלות לביצוע ומאוד ניתנות לשחזור, הן ללא ספק גישות רדוקציוניסטיות ואינן מייצגות בהכרח השתקפות מדויקת של תנאי vivo.
בעכברים, בדיקה נפוצה לחקר חמידות פראלית במעיים היא על ידי gavage אוראלי של FITC-dextran ומדידה לאחר מכן של FITC-dextran מראה בסרום הדם13,17. החיסרון של בדיקת זה הוא שזה מייצג הערכה של שלמות המחסום הכוללת של מערכת העיכול ולא של תרומות מעיים אזוריות. בנוסף, כחול אוונס משמש בדרך כלל להערכת דליפת כלי דם ב vivo18 וגם הועסק כדי להעריך חמלות רירית מעיים בעכבר וחולדה19,20,21. הכימות של כחול אוונס ברירית המעי דורש מיצוי מרקמות המעסיקות דגירה בפורמאמיד בן לילה. לכן, אותה רקמה לא יכולה לשמש לחקר חדירות אפיתל מעיים וחדירת נויטרופילים.
כאן אנו מדגישים פרוטוקול פשוט המפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לאיסוף נתונים לשחזור על חלחוביות הרירית המעי הגס ונדידת לויקוציטים טרנספיטהל ב vivo. אנו, אם כן, ממליצים על השימוש FITC-dextrans כי ניתן לזהות בקלות בסרום דם מבלי להתפשר על שלמות לולאות מעיים אשר ניתן לקצור לניתוח נוסף. ראוי לציין, לולאות קשירה מעיים שימשו במינים שונים (כולל עכבר, חולדה, ארנב, עגל) כדי לחקור זיהום חיידקי (כגון סלמונלה, ליסטריה monocytogenes ו Escherichia coli)22,23,24,25, כמו גם חמיצות מעיים26; עם זאת, למיטב ידיעתנו אין מחקרים החוקרים מנגנונים של PMN TEpM באזורים ספציפיים במעי כגון ileum או המעי הגס המעורבים בדרך כלל IBD.
כאן אנו מתארים את מודל לולאת מעי העכבר (iLoop) שהוא שיטת vivo מיקרוכירורגית חזקה ואמינה המעסיקה מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים של האיליום או המעי הגס הפרוקסימלי. מודל iLoop רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומאפשר הערכה של שלמות מחסום המעי ו- PMN TEpM על עכברים חיים תחת הרדמה. אנו מדגימים שני יישומים: 1) כימות של רמות סרום של 4 kDa FITC-dextran לאחר ניהול תוך-אלומינאלי ב- iLoop 2) כימות של PMN transmigrated ב- iLoop לומן לאחר הזרקה תוך-אלומינלית של chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. יתר על כן, ניצול מודל iLoop עם עכברים או עכברים או עכברים אועכברים המכילים אובדן סלקטיבי של JAM-A על IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) בהשוואה לעכברי בקרה, אנו מסוגלים לאמת מחקרים קודמים שדיווחו על תרומה משמעותית לחלבון צמוד הקשור לצומת JAM-A לחלחיליות במעיים ולהעברת נויטרופילים15,28,29,30,31.
מודל iLoop הוא שיטה פונקציונלית ופיזיולוגית מאוד שניתן להשתמש בה כדי לאשש במבחנות. יתר על כן, זהו מודל ניסיוני רב-תכליתי המאפשר לחקור ריאגנטים שונים שניתן להזריק ללומן הלולאה, כולל כימותרפיה, ציטוקינים, פתוגנים חיידקיים, רעלנים, נוגדנים וטיפולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המנגנונים האחראים על dysregulation של תפקוד מחסום המעי וגיוס תאי מערכת החיסון בתנאים פתולוגיים כגון IBD אינם מובנים לחלוטין. כאן, אנו מפרטים מודל חזק ב vivo murine אשר מעסיק קטע מעיים חיצוני היטב של ileum או המעי הגס הפרוקסימלי ומאפשר הערכה של חדירה במעיים, מחקרי הגירה נויטרופילים, כמו גם יישומים אחרים.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר סוון פלמינג מאוניברסיטת וירצבורג על תרומתו להקמת מודל לולאת המעי הגס הפרוקסימלי, שון ווטסון על ניהול מושבות העכברים וצ’ית’רה ק. מוראלדהרן על שעזרו ברכישת התמונות של מודל iLoop. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית /DFG (BO 5776/2-1) ל- KB, R01DK079392, R01DK072564 ו- R01DK061379 ל- C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
References
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
- Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn’s disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
- Michielan, A., D’Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
- Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
- Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
- Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
- Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
- Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
- Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
- Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
- Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
- Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
- Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
- Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
- Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
- Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
- Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
- Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , e5024 (2020).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
- Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
- Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
- Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
- Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
- Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).
