Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

Het darmslijmvlies omvat een enkele laag zuilvormige intestinale epitheelcellen (IECs), onderliggende lamina propria immuuncellen en het muscularis-slijmvlies. Naast zijn rol in de opname van voedingsstoffen, is het darmepitheel een fysieke barrière die het lichaamsinterieur beschermt tegen luminale commensale bacteriën, pathogenen en voedingsantigenen. Bovendien coördineren IECs en lamina propria immuuncellen de immuunrespons die tolerantie of respons induceert, afhankelijk van de context en stimuli. Er is gemeld dat de verstoring van de epitheliale barrière kan voorafgaan aan het begin van pathologische mucosale ontsteking en kan bijdragen aan inflammatoire darmziekte (IBD) die zowel colitis ulcerosa als de ziekte van Crohn^{omvat 1,2,3,4,5,6,7}. Personen met colitis ulcerosa vertonen overmatige transepitheliale migratie (TEpM) van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) die crypte abcessen vormen, een bevinding die is geassocieerd met de ernst van ziekte^8,9. Hoewel gecompromitteerde epitheliale barrièrefunctie en overmatige immuunresponsen kenmerken van IBD zijn, is er een gebrek aan experimentele in vivo assays om kwantitatieve beoordelingen van intestinale permeabiliteit en immuuncelwerving in het darmslijmvlies uit te voeren.

De meest gebruikte methoden voor het bestuderen van intestinale epitheliale permeabiliteit en PMN TEpM maken gebruik van ex vivo kamergebaseerde benaderingen met behulp van IEC-monolagen gekweekt op semi-permeabele poreuze membraaninzetstukken^10,11,12. De integriteit van de epitheelbarrière wordt gecontroleerd door metingen van transepitheliale elektrische weerstand (TEER) of de paracellulaire flux van het Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabelde dextran van apicaal naar basaal^{compartiment 13,14,15}. Evenzo wordt PMN TEpM meestal bestudeerd als reactie op een chemoattractant dat wordt toegevoegd in de onderste kamer¹⁶. PMN wordt in de bovenste kamer geplaatst en na een incubatieperiode wordt PMN dat naar het basale compartiment is gemigreerd verzameld en gekwantificeerd. Hoewel deze methoden nuttig, gemakkelijk uit te voeren en zeer reproduceerbaar zijn, zijn het duidelijk reductionistische benaderingen en vertegenwoordigen ze niet noodzakelijkerwijs een nauwkeurige weerspiegeling van in vivo omstandigheden.

Bij muizen is een veel voorkomende test om de intestinale paracellulaire permeabiliteit te bestuderen door orale gavage van FITC-dextran en daaropvolgende meting van fitc-dextran uiterlijk in het bloedserum^13,17. Het nadeel van deze test is dat het een beoordeling is van de algehele barrière-integriteit van het maagdarmkanaal in plaats van die van regionale darmbijdragen. Bovendien wordt Evans blue vaak gebruikt om vasculaire lekkage in vivo¹⁸ te evalueren en is het ook gebruikt om de darmslijmvliesdoorlaatbaarheid bij muis en rat^19,20,21te evalueren . De kwantificering van Evans blauw in het darmslijmvlies vereist extractie uit weefsel met behulp van incubatie in formamide ‘s nachts. Daarom kan hetzelfde weefsel niet worden gebruikt om intestinale epitheelpermeabiliteit en neutrofiele infiltratie te bestuderen.

Hier benadrukken we een eenvoudig protocol dat het aantal dieren vermindert dat nodig is om reproduceerbare gegevens te verzamelen over darmslijmvliespermeabiliteit en leukocyten transepitheliale migratie in vivo. Daarom raden we het gebruik van FITC-dextrans aan die gemakkelijk detecteerbaar zijn in bloedserum zonder de integriteit van darmlussen in gevaar te brengen die kunnen worden geoogst voor verdere analyse. Van belang is dat de intestinale ligated loops zijn gebruikt bij verschillende soorten (waaronder muis, rat, konijn, kalf) om bacteriële infecties (zoals Salmonella, Listeria monocytogenes en Escherichia coli)^22,23,24,25 en intestinale permeabiliteit²⁶te bestuderen; voor zover wij weten zijn er echter geen studies die mechanismen van PMN TEpM onderzoeken in specifieke regio’s in de darm zoals ileum of dikke darm die vaak betrokken zijn bij IBD.

Hier beschrijven we het muis intestinale lus (iLoop) model dat een robuuste en betrouwbare microchirurgische in vivo methode is die een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment van het ileum of proximale dikke darm gebruikt. Het iLoop-model is fysiologisch relevant en maakt de beoordeling van de integriteit van de darmbarrière en PMN TEpM op levende muizen onder narcose mogelijk. We demonstreren twee toepassingen: 1) kwantificering van serumspiegels van 4 kDa FITC-dextran na intraluminale toediening in de iLoop 2) kwantificering van getransmigreerd PMN in het iLoop lumen na intraluminale injectie van het krachtige chemottractant Leukotriene B₄ (LTB₄)²⁷. Bovendien, het gebruik van het iLoop-model met Jam-a-null muizen of muizen die selectief verlies van JAM-A op IECs(Villin-cre; Jam-a ^fl/fl) in vergelijking met controlemuizen, kunnen we eerdere studies bevestigen die een belangrijke bijdrage hebben gemeld voor nauw junction-geassocieerd eiwit JAM-A aan intestinale permeabiliteit en neutrofiele transmigratie^{15,28,29,30,31}.

Het iLoop-model is een zeer functionele en fysiologische methode die kan worden gebruikt om in vitro assays te bevestigen. Bovendien is dit een veelzijdig experimenteel model dat de studie mogelijk maakt van verschillende reagentia die in het luslumen kunnen worden geïnjecteerd, waaronder chemokinen, cytokinen, bacteriële pathogenen, toxines, antilichamen en therapieën.