التقييم الوظيفي نفاذية الأمعاء والهجرة العدلية عبر الإبط في الفئران باستخدام نموذج حلقة معوية موحدة
Summary
Dysregulated وظيفة الحاجز الظهاري المعوي والاستجابات المناعية هي السمات المميزة لمرض التهاب الأمعاء التي لا تزال سيئة التحقيق بسبب عدم وجود نماذج فسيولوجية. هنا، ونحن نصف نموذج حلقة الماوس المعوية التي توظف قطاع الأمعاء الأوعية الدموية جيدا والخارجي لدراسة نفاذية المخاطية والتوظيف الكريات البيض في الجسم الحي.
Abstract
واصطف الغشاء المخاطي المعوي من قبل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي تشكل حاجزا ديناميكيا يسمح النقل شبه الخلوي من المواد الغذائية والماء مع منع مرور البكتيريا المضيء والمواد الخارجية. يؤدي خرق هذه الطبقة إلى زيادة نفاذية المحتويات الإنارة وتجنيد الخلايا المناعية ، وكلاهما من السمات المميزة للدول المرضية في الأمعاء بما في ذلك مرض الأمعاء الالتهابي (IBD).
الآليات التي تنظم وظيفة الحاجز الظهاري والهجرة عبر الإبطية (TEpM) من العدلات متعددة الأشكال (PMN) غير مفهومة بشكل كامل بسبب عدم وجود طرق تجريبية في الجسم الحي تسمح بالتحليل الكمي. هنا، ونحن نصف نموذج تجريبي مورين قوية التي توظف الجزء المعوي الخارجي من القولون إما الايليوم أو قريبة. الحلقة المعوية الخارجية (iLoop) هي الأوعية الدموية بالكامل وتوفر مزايا فسيولوجية على النهج القائمة على غرفة الجسم الحي السابق المستخدمة عادة لدراسة نفاذية وهجرة PMN عبر أحاديات الخلايا الظهارية.
نحن نبين تطبيقين لهذا النموذج بالتفصيل: (1) القياس الكمي نفاذية الأمعاء من خلال الكشف عن ديكسترانس المسمى بالفلورسينس في المصل بعد الحقن داخل الألومين ، (2) التقييم الكمي لPMN المهاجرة عبر الظهارة المعوية في تجويف الأمعاء بعد إدخال المضادات الكيميائية داخل الألومين. نحن نظهر جدوى هذا النموذج وتوفير النتائج باستخدام iLoop في الفئران تفتقر إلى الظهارية ضيق تقاطع المرتبطة البروتين JAM-A بالمقارنة مع الضوابط. وقد ثبت JAM-A لتنظيم وظيفة الحاجز الظهاري، فضلا عن PMN TEpM خلال الاستجابات الالتهابية. نتائجنا باستخدام iLoop تؤكد الدراسات السابقة وتسليط الضوء على أهمية JAM-A في تنظيم نفاذية الأمعاء وPMN TEpM في الجسم الحي أثناء التوازن والمرض.
نموذج iLoop يوفر طريقة موحدة للغاية للاستنساخ في دراسات الجسم الحي من التوازن المعوي والالتهاب، وسوف تعزز بشكل كبير فهم وظيفة حاجز الأمعاء والتهاب المخاطية في أمراض مثل IBD.
Introduction
الغشاء المخاطي المعوي يشمل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية المعوية العمودية (IECs)، والخلايا المناعية الكامنة وراء لامينا البربريا والغشاء المخاطي العضلي. إلى جانب دورها في امتصاص المواد الغذائية ، فإن الظهارة المعوية هي حاجز مادي يحمي الجسم الداخلي من البكتيريا commensal الإنارة ، مسببات الأمراض ، والمضادات الغذائية. بالإضافة إلى ذلك، تنسق الخلايا المناعية IECs وlamina propria الاستجابة المناعية التي تحفز إما التسامح أو الاستجابة اعتمادا على السياق والمحفزات. وقد أفيد أن اضطراب الحاجز الظهاري يمكن أن يسبق ظهور التهاب المخاطية المرضية والمساهمة في مرض التهاب الأمعاء (IBD) التي تشمل كل من التهاب القولون التقرحي ومرض كرون1،2،3،4،5،6،7. الأفراد الذين يعانون من التهاب القولون التقرحي تقديم الهجرة عبر الظهارية المفرطة (TEpM) من العدلات متعددة الأشكال (PMN) تشكيل خراجات سرداب, النتيجة التي ارتبطت مع شدة المرض8,9. على الرغم من أن وظيفة الحاجز الظهاري للخطر والاستجابات المناعية المفرطة هي السمات المميزة ل IBD ، إلا أن هناك نقصا في المقايسات التجريبية في الجسم الحي لإجراء تقييمات كمية نفاذية الأمعاء وتجنيد الخلايا المناعية في الغشاء المخاطي المعوي.
الأساليب الأكثر شيوعا المستخدمة لدراسة نفاذية الظهارية المعوية وPMN TEpM توظيف نهج سابقة فيفو غرفة القائمة باستخدام monolayers IEC المستزرعة على غشاء مسامية شبه نفاذية إدراج10،11،12. يتم رصد سلامة الحاجز الظهاري إما عن طريق قياسات المقاومة الكهربائية عبر الإبط (TEER) أو التدفق شبه الخلوي للنظائر الفلوريسين (FITC) المسمى dextran من المقصورة القاعدية13،14،15. وبالمثل، عادة ما تدرس PMN TEpM ردا على chemoattractant التي تضاف في الغرفة السفلى16. يتم وضع PMN في الغرفة العليا وبعد فترة حضانة ، يتم جمع PMN التي هاجرت إلى المقصورة القاعدية وقياسها كميا. في حين أن هذه الأساليب مفيدة وسهلة الأداء وقابلة للاستنساخ للغاية ، فمن الواضح أنها نهج اختزالية ولا تمثل بالضرورة انعكاسا دقيقا للظروف في الجسم الحي.
في الفئران ، والمقايسة الشائعة لدراسة نفاذية الأمعاء paracellular هو عن طريق الفم من gavage FITC – dextran والقياس اللاحقة من FITC – dextran المظهر في مصل الدم13،17. وعيب هذا المقايسة هو أنه يمثل تقييما لسلامة الحاجز العام للجهاز الهضمي بدلا من تقييم المساهمات المعوية الإقليمية. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم ايفانز الأزرق عادة لتقييم تسرب الأوعية الدموية في الجسم الحي18، كما تم استخدامها لتقييم نفاذية المخاطية المعوية في الماوس والفأر19،20،21. يتطلب القياس الكمي لإيفانز الأزرق في الغشاء المخاطي المعوي الاستخراج من الأنسجة التي تستخدم الحضانة في فورماميد بين عشية وضحاها. لذلك ، لا يمكن استخدام نفس النسيج لدراسة نفاذية الظهارية المعوية وتسلل العدلات.
هنا نسلط الضوء على بروتوكول بسيط يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لجمع البيانات القابلة للاستنساخ حول نفاذية القولون المخاطية والهجرة عبر الإبطية الكريات البيض في الجسم الحي. لذلك، نوصي باستخدام FITC-dextrans التي يمكن اكتشافها بسهولة في مصل الدم دون المساس بسلامة الحلقات المعوية التي يمكن حصادها لمزيد من التحليل. وتجدر الإشارة إلى أن الحلقات المعوية ذات الخلايا المتوارثة قد استخدمت في أنواع مختلفة (بما في ذلك الماوس والفأر والأرنب والعجل) لدراسة العدوى البكتيرية (مثل السالمونيلا والليستيريا أحادية الخلايا والإشريكية القولونية)22و23و24و25 بالإضافة إلى نفاذية الأمعاء26؛ ومع ذلك، على حد علمنا لا توجد دراسات التحقيق آليات PMN TEpM في مناطق محددة في الأمعاء مثل الإيليوم أو القولون التي تشارك عادة في IBD.
هنا نحن نصف الماوس حلقة معوية (iLoop) نموذج الذي هو microsurgical قوية وموثوق بها في طريقة فيفو الذي يستخدم شريحة الأمعاء جيدا الأوعية الدموية والخارجية من القولون إما الايليوم أو قريبة. نموذج iLoop ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ويسمح بتقييم سلامة حاجز الأمعاء وPMN TEpM على الفئران الحية تحت التخدير. نحن نثبت تطبيقين: 1) القياس الكمي لمستويات المصل من 4 kDa FITC-dextran بعد الإدارة داخل الألومين في iLoop 2) القياس الكمي لPMN المتحولة في تجويف iLoop بعد الحقن داخل الألومين من اللوكوترين القوي الكيميائي B4 (LTB4)27. وعلاوة على ذلك، الاستفادة من نموذج iLoop مع الفئران جام-أ-فارغةأو الفئران التي تؤوي خسارة انتقائية من JAM-A على IECs(Villin-cre; جام-أ fl/fl)بالمقارنةمع الفئران السيطرة، ونحن قادرون على تأكيد الدراسات السابقة التي أبلغت عن مساهمة كبيرة لضيق تقاطع المرتبطة البروتين JAM-A إلى نفاذية الأمعاء وهجر العدلات15،28،29،30،31.
نموذج iLoop هو أسلوب وظيفي وفسيولوجي للغاية يمكن استخدامه لتأكيد المقايسات في المختبر. وعلاوة على ذلك، هذا هو نموذج تجريبي متعدد الاستخدامات التي تسمح لدراسة الكواشف المختلفة التي يمكن حقنها في التجويف حلقة، بما في ذلك chemokines، السيتوكينات، مسببات الأمراض البكتيرية، والسموم، والأجسام المضادة والعلاجات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الآليات المسؤولة عن dysregulation من وظيفة حاجز الأمعاء وتجنيد الخلايا المناعية في ظل ظروف مرضية مثل IBD غير مفهومة بشكل كامل. هنا، ونحن بالتفصيل قوية في نموذج المورين فيفو الذي يستخدم شريحة الأمعاء الخارجية الأوعية الدموية جيدا من القولون إما الايليوم أو قريبة ويسمح لتقييم نفاذية الأمعاء، ودرا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور سفين فليمنغ من جامعة فيرزبورغ على مساهماته في إنشاء نموذج حلقة القولون القريبة ، وشون واتسون لإدارة مستعمرات الماوس وتشيثرا ك. موراليداران للمساعدة في الحصول على صور نموذج iLoop. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية /DFG (BO 5776/2-1) إلى KB وR01DK079392 وR01DK072564 وR01DK061379 إلى C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
References
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
- Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn’s disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
- Michielan, A., D’Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
- Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
- Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
- Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
- Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
- Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
- Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
- Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
- Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
- Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
- Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
- Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
- Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
- Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
- Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
- Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , e5024 (2020).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
- Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
- Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
- Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
- Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
- Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).
