Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

Die Darmschleimhaut umfasst eine einzige Schicht aus säulenförmigen Darmepithelzellen (IECs), darunter liegenden Lamina propria Immunzellen und den Muscularis mucosae. Neben seiner Rolle bei der Aufnahme von Nährstoffen ist das Darmepithel eine physikalische Barriere, die das Körperinnere vor luminalen kommensalen Bakterien, Krankheitserregern und diätetischen Antigenen schützt. Darüber hinaus koordinieren IECs und Lamina propria-Immunzellen die Immunantwort, die je nach Kontext und Reizen entweder Toleranz oder Reaktion induziert. Es wurde berichtet, dass die Störung der Epithelbarriere dem Beginn einer pathologischen Schleimhautentzündung vorausgehen und zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) beitragen^kann,die sowohl Colitis ulcerosa als auch Morbus Crohn^{umfassen 1,2,}3 ,^4,5,^6,7. Personen mit Colitis ulcerosa zeigen eine übermäßige transepitheliale Migration (TEpM) von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN), die Kryptenabszesse bilden, ein Befund, der mit der Schwere der Erkrankung in Verbindung gebracht wurde^8,9. Obwohl eine beeinträchtigte epitheliale Barrierefunktion und übermäßige Immunantworten Kennzeichen von IBD sind, fehlt es an experimentellen In-vivo-Assays, um quantitative Bewertungen der Darmpermeabilität und der Rekrutierung von Immunzellen in die Darmschleimhaut durchzuführen.

Die gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung der intestinalen epithelialen Permeabilität und PMN TEpM verwenden ex vivo kammerbasierte Ansätze unter Verwendung von IEC-Monoschichten, die auf semipermeablen porösen Membraneinsätzen^10,11,12kultiviert werden. Die Integrität der epithelialen Barriere wird entweder durch Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) oder des parazellulären Flusses des Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierten Dextrans vom apikalen zum basalen Kompartiment^13,14,15überwacht. In ähnlicher Weise wird PMN TEpM typischerweise als Reaktion auf ein Chemoattraktum untersucht, das in der unteren Kammer¹⁶hinzugefügt wird. PMN werden in die obere Kammer gelegt und nach einer Inkubationszeit werden PMN, die in das Basalkompartiment gewandert sind, gesammelt und quantifiziert. Während diese Methoden nützlich, einfach durchzuführen und sehr reproduzierbar sind, sind sie offensichtlich reduktionistische Ansätze und stellen nicht unbedingt eine genaue Reflexion der In-vivo-Bedingungen dar.

Bei Mäusen ist ein gängiger Assay zur Untersuchung der intestinalen parazellulären Permeabilität durch orale Gavage von FITC-Dextran und anschließende Messung des FITC-Dextran-Aussehens im Blutserum^13,17. Der Nachteil dieses Assays besteht darin, dass er eine Beurteilung der allgemeinen Barriereintegrität des Magen-Darm-Trakts und nicht die der regionalen Darmbeiträge darstellt. Darüber hinaus wird Evans-Blau häufig verwendet, um vaskuläre Leckagen in vivo¹⁸ zu bewerten, und wurde auch verwendet, um die Darmschleimhautpermeabilität bei Maus und Ratte^19,20,21zu bewerten . Die Quantifizierung von Evansblau in der Darmschleimhaut erfordert die Extraktion aus Gewebe, das über Nacht in Formamid inkubiert wird. Daher kann das gleiche Gewebe nicht verwendet werden, um die intestinale epitheliale Permeabilität und die Neutrophileninfiltration zu untersuchen.

Hier heben wir ein einfaches Protokoll hervor, das die Anzahl der Tiere reduziert, die benötigt werden, um reproduzierbare Daten über die Durchlässigkeit der Kolonschleimhaut und die transepitheliale Migration von Leukozyten in vivo zu sammeln. Wir empfehlen daher die Verwendung von FITC-Dextrans, die im Blutserum leicht nachweisbar sind, ohne die Integrität der Darmschlingen zu beeinträchtigen, die für weitere Analysen geerntet werden können. Bemerkenswert ist, dass die intestinalen ligaierten Schleifen bei verschiedenen Arten (einschließlich Maus, Ratte, Kaninchen, Kalb) verwendet wurden, um bakterielle Infektionen (wie Salmonellen, Listeria monocytogenes und Escherichia coli)^22,23,24,25 sowie Darmpermeabilität²⁶zu untersuchen; Nach unserem besten Wissen gibt es jedoch keine Studien, die Mechanismen von PMN TEpM in bestimmten Regionen des Darms wie Ileum oder Dickdarm untersuchen, die häufig an IBD beteiligt sind.

Hier beschreiben wir das Maus-Darmschleifenmodell (iLoop), das eine robuste und zuverlässige mikrochirurgische In-vivo-Methode ist, die ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment des Ileums oder des proximalen Dickdarms verwendet. Das iLoop-Modell ist physiologisch relevant und ermöglicht die Beurteilung der Darmbarriereintegrität und PMN TEpM an lebenden Mäusen unter Betäubung. Wir zeigen zwei Anwendungen: 1) Quantifizierung der Serumspiegel von 4 kDa FITC-Dextran nach intraluminaler Verabreichung im iLoop 2) Quantifizierung von transmigriertem PMN im iLoop-Lumen nach intraluminaler Injektion des starken Chemottraktans Leukotrien_B4 (LTB₄₎²⁷. Darüber hinaus wird das iLoop-Modell mit Jam-a-null-Mäusenoder Mäusen verwendet, die einen selektiven Verlust von JAM-A auf IECs (Villin-cre; Jam-a ^fl/fl) im Vergleich zu Kontrollmäusen können wir frühere Studien bestätigen, die einen wichtigen Beitrag für Tight Junction-assoziiertes Protein JAM-A zur Darmpermeabilität und neutrophilen Transmigration berichtet haben^{15,28,29,30,31}.

Das iLoop-Modell ist eine hochfunktionelle und physiologische Methode, mit der In-vitro-Assays bestätigt werden können. Darüber hinaus ist dies ein vielseitiges experimentelles Modell, das die Untersuchung verschiedener Reagenzien ermöglicht, die in das Schleifenlumen injiziert werden können, einschließlich Chemokine, Zytokine, bakterielle Krankheitserreger, Toxine, Antikörper und Therapeutika.