Функциональная оценка кишечной проницаемости и трансэпителиальной миграции нейтрофилов у мышей с использованием стандартизированной модели кишечной петли

Слизистая оболочка кишечника включает в себя один слой столбчатых эпителиальных клеток кишечника (IIC), лежащих в основе иммунных клеток lamina propria и слизистых мышц. Помимо своей роли в поглощении питательных веществ, эпителий кишечника является физическим барьером, который защищает внутреннюю часть организма от просветных комменсальных бактерий, патогенов и диетических антигенов. Кроме того, ИЭК и иммунные клетки lamina propria координируют иммунный ответ, вызывая либо толерантность, либо реакцию в зависимости от контекста и стимулов. Сообщалось, что нарушение эпителиального барьера может предшествовать возникновению патологического воспаления слизистой оболочки и способствовать воспалительным заболеваниям кишечника (ВЗК), охватывающим как язвенный^колит,так и болезнь Крона^{1,2,3,4,5,6,7.} Лица с язвенным колитом представляют чрезмерную трансэпителиальную миграцию (TEpM) полиморфноядерных нейтрофилов (PMN), образующих абсцессы крипты, что было связано с тяжестью заболевания^8,9. Хотя нарушенная эпителиальная барьерная функция и чрезмерные иммунные реакции являются отличительными признаками ВЗК, отсутствуют экспериментальные анализы in vivo для выполнения количественных оценок проницаемости кишечника и рекрутации иммунных клеток в слизистую оболочку кишечника.

Наиболее распространенные методы, используемые для исследования проницаемости эпителия кишечника и PMN TEpM, используют подходы на основе камер ex vivo с использованием монослоев МЭК, культивируемых на полупроницаемых пористых мембранных вставках^10,11,12. Целостность эпителиального барьера контролируется либо измерениями трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), либо параклеточного потока флуоресцеина изотиоцианата (FITC), меченого декстраном от апикального до базального компартмента^13,14,15. Аналогичным образом, PMN TEpM обычно изучается в ответ на хемоатрактант, который добавляют в нижнюю камеру^16. ПМН помещают в верхнюю камеру, и после инкубационного периода ПМН, которые мигрировали в базальный отсек, собирают и количественно оценивают. Хотя эти методы полезны, просты в исполнении и очень воспроизводимы, они, очевидно, являются редукционистскими подходами и не обязательно представляют собой точное отражение условий in vivo.

У мышей распространенным анализом для изучения кишечной параклеточной проницаемости является пероральный прием FITC-декстрана и последующее измерение появления FITC-декстрана в сыворотке крови^13,17. Недостатком этого анализа является то, что он представляет собой оценку общей барьерной целостности желудочно-кишечного тракта, а не регионального кишечного вклада. Кроме того, синий Эванс обычно используется для оценки сосудистой утечки in vivo^18, а также был использован для оценки проницаемости слизистой оболочки кишечника у мышей и крыс^19,20,21. Количественная оценка синего цвета Эванса в слизистой оболочке кишечника требует извлечения из ткани с использованием инкубации в формамиде в течение ночи. Поэтому одну и ту же ткань нельзя использовать для изучения проницаемости эпителия кишечника и нейтрофильной инфильтрации.

Здесь мы выделяем простой протокол, который уменьшает количество животных, необходимых для сбора воспроизводимых данных о проницаемости слизистой оболочки толстой кишки и трансэпителиальной миграции лейкоцитов in vivo. Поэтому мы рекомендуем использовать FITC-декстранс, которые легко обнаруживаются в сыворотке крови без ущерба для целостности кишечных петель, которые могут быть собраны для дальнейшего анализа. Следует отметить, что кишечные лигированные петли использовались у различных видов (включая мышь, крысу, кролика, теленка) для изучения бактериальной инфекции (такой как Salmonella, Listeria monocytogenes и Escherichia coli)^22,23,24,25, а также кишечной проницаемости^26; однако, насколько нам известно, нет исследований, изучающих механизмы PMN TEpM в определенных областях кишечника, таких как подвздошная кишка или толстая кишка, которые обычно участвуют в ВЗК.

Здесь мы описываем модель кишечной петли мыши (iLoop), которая является надежным и надежным микрохирургическим методом in vivo, который использует хорошо васкуляризованный и экстериоризованный кишечный сегмент подвздошной или проксимальной толстой кишки. Модель iLoop физиологически актуальна и позволяет оценить целостность кишечного барьера и PMN TEpM на живых мышах под наркозом. Мы демонстрируем два применения: 1) количественная оценка сывороточных уровней 4 кДа FITC-декстрана после внутрипросветного введения в iLoop 2) количественная оценка трансмигрированного PMN в просвете iLoop после внутрипросветного введения мощного хемоттрактанта Лейкотриена B₄ (LTB₄₎^27. Кроме того, использование модели iLoop с мышами Jam-a-null или мышами, переносимыми селективную потерю JAM-A на IIC(Villin-cre; Jam-a ^fl/fl) по сравнению с контрольными мышами, мы можем подтвердить предыдущие исследования, в которых сообщалось о значительном вкладе в плотное соединение-ассоциированный белок JAM-A в проницаемость кишечника и трансмиграцию нейтрофилов^{15,28,29,30,31.}

Модель iLoop является высокофункциональным и физиологическим методом, который может быть использован для подтверждения анализов in vitro. Кроме того, это универсальная экспериментальная модель, которая позволяет изучать различные реагенты, которые могут быть введены в просвет петли, включая хемокины, цитокины, бактериальные патогены, токсины, антитела и терапевтические средства.