גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות
Summary
כאן, אנו מתארים כלים ושיטות חישוביות המאפשרים הדמיה וניתוח של נתוני תמונה תלת-ממדיים וארבעה מימדיים של עוברי עכבר בהקשר של התארכות צירית וסגמנטציה, המתקבלים על ידי טומוגרפיה של הקרנה אופטית טוטו, ועל ידי הדמיה חיה וכתם אימונופלואורסצנטי בהר שלם באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית.
Abstract
סומיטוגנזה הוא סימן היכר של התפתחות עוברית חוליות. במשך שנים, חוקרים חקרו את התהליך הזה במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות מגוון רחב של טכניקות המקיפות גישות ex vivo ו במבחנה. עם זאת, רוב המחקרים עדיין מסתמכים על ניתוח של נתוני הדמיה דו-ממדיים (דו-ממדיים), המגבילים הערכה נכונה של תהליך התפתחותי כמו הרחבה צירית וסומיטוגנזה המערבת אינטראקציות דינמיות מאוד במרחב תלת-ממדי מורכב. כאן אנו מתארים טכניקות המאפשרות רכישת הדמיה חיה של עכבר, עיבוד ערכת נתונים, הדמיה וניתוח בתלת-ממד וב-4D כדי לחקור את התאים (למשל, אבות עצביים) המעורבים בתהליכים התפתחותיים אלה. אנו מספקים גם פרוטוקול שלב אחר שלב לטומוגרפיה של הקרנה אופטית ומיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה בעוברי עכבר (מהכנה מדגמית לרכישת תמונה) ומציגים צינור שפיתחנו לעיבוד ולהדמיה של נתוני תמונה תלת-ממדית. אנו מרחיבים את השימוש בכמה מטכניקות אלה ומדגישים תכונות ספציפיות של תוכנות זמינות שונות (למשל, פיג’י / ImageJ, Drishti, Amira ו- Imaris) שניתן להשתמש בהן כדי לשפר את ההבנה הנוכחית שלנו של הרחבה צירית ויצירת somite (למשל, שחזורים תלת-ממדיים). בסך הכל, הטכניקות המתוארות כאן מדגישות את החשיבות של הדמיה וניתוח נתונים תלת-ממדיים בביולוגיה התפתחותית, ועשויות לסייע לחוקרים אחרים לטפל טוב יותר בנתוני תמונה תלת-ממדית ודו-ממדית בהקשר של הרחבה צירית וסגמנטציה של בעלי חוליות. לבסוף, העבודה משתמשת גם בכלים חדשניים כדי להקל על הוראת התפתחות עוברית של בעלי חוליות.
Introduction
היווצרות ציר גוף חוליות היא תהליך מורכב ודינמי ביותר המתרחש במהלך התפתחות עוברית. בסוף גסטרולציה [בעכבר, סביב יום עוברי (E) 8.0], קבוצה של תאי אב אפיבלסט המכונה אבות נוירומסודרמליים (NMPs) הופכים לנהג מפתח של הרחבה צירית ברצף ראש לזנב, יצירת הצינור העצבי ורקמות mesodermal paraxial במהלך היווצרות הצוואר, תא המטען והזנב 1,2,2,3,4 . מעניין, העמדה כי NMPs אלה תופסים epiblast caudal נראה לשחק תפקיד מפתח בהחלטה של הבחנה לתוך mesoderm או neuroectoderm5. למרות שכרגע חסרה לנו טביעת אצבע מולקולרית מדויקת עבור NMPs, תאים אלה נחשבים בדרך כלל ל- Co-express T (Brachyury) ו- Sox2 5,6. המנגנונים המדויקים המסדירים את החלטות הגורל של NMP (כלומר, בין אם הם לוקחים מסלולים עצביים או מסודרמליים) רק מתחילים להיות מוגדרים במדויק. ביטוי Tbx6 באזור הפס הפרימיטיבי הוא סמן מוקדם של החלטת גורל NMP, כמו גן זה מעורב אינדוקציה ומפרט של mesoderm 6,7. מעניין, תאי mesoderm מוקדם נראה לבטא רמות גבוהות של Epha18, Wnt / β-קטנין איתות, כמו גם Msgn1 הוצגו גם לשחק תפקידים חשובים בבידול mesoderm paraxial ו היווצרות somite 9,10. ניתוח מרחבי-זמני מלא של NMPs ברמה של תא יחיד בהחלט יהיה אינסטרומנטלי כדי להבין באופן מלא את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט mesoderm.
היווצרות של somites (מבשרי חוליות) היא תכונה מרכזית של בעלי חוליות. במהלך התארכות צירית, mesoderm paraxial הופך מקוטע בסדרה של יחידות חוזרות דו צדדיות המכונה somites. מספר הסומיטים והזמן הנדרש להיווצרות מקטעים חדשים משתנה בין מינים11,12. Somitogenesis כרוך תנודות איתות תקופתיות (המכונה “שעון פילוח”) שניתן לראות על ידי הביטוי המחזורי של מספר גנים של חריץ, Wnt ו Fgf איתות מסלולים במסודרמה presomitic (למשל, Lfng)11,12. המודל הנוכחי של סמיטוגנזה גם מניח את קיומו של “חזית גל התבגרות”, סדרה של שיפועי איתותים מורכבים הכוללים Fgf, Wnt ואיתות חומצה רטינואית המגדירים את המיקום של הגבול האחורי של כל סומיט חדש. אינטראקציה מתואמת בין “שעון הפילוח” לבין “חזית גל ההבשלה” היא אפוא בסיסית ליצירת מודולים מבשרים אלה של חוליות, שכן הפרעות בתהליכים מורפוגנטיים מרכזיים אלה עלולות לגרום לקטלניות עוברית או להיווצרות מומים מולדים (למשל, עקמת)13,14,15.
למרות התקדמות משמעותית לאחרונה בטכניקות הדמיה, שיטות ניתוח ביו-דימאז’ ותוכנה, רוב המחקרים של התארכות צירית וסומיטוגנזה עדיין מסתמכים על נתוני תמונה דו-ממדיים חד-ממדיים/מבודדים (למשל, מקטעים), שאינם מאפשרים הדמיה מלאה של רקמות רב-ממדיות ומסבך הבחנה ברורה בין מומים פתולוגיים (כלומר עקב מוטציות) לעומת וריאציה מורפולוגית רגילה המתרחשת במהלך התפתחות עוברית16 . הדמיה בתלת-ממד כבר חשפה תנועות מורפוגנטיות חדשניות, שלא זוהו בעבר בשיטות דו-ממדיות סטנדרטיות 17,18,19,20, המדגישות את כוחה של הדמיית טוטו להבין את המנגנונים של סמיטוגנזה חוליות והרחבה צירית.
מיקרוסקופיה תלת-ממדית ותלת-ממדית של עוברי עכבר, במיוחד הדמיה חיה, הם מאתגרים מבחינה טכנית ודורשים צעדים קריטיים במהלך הכנת מדגם, רכישת תמונה ועיבוד נתונים מראש על מנת לאפשר ניתוח מרחבי-זמני מדויק ומשמעותי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להדמיה חיה והכתמת אימונופלואורסצנטיות בהר שלם של עוברים עכברים, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור הן NMPs והן תאים מסודרמליים במהלך הרחבה צירית וסגמנטציה. בנוסף, אנו מתארים גם פרוטוקול לטומוגרפיה של הקרנה אופטית (OPT) של עוברים ועוברים ישנים יותר, המאפשר הדמיה תלת-ממדית של טוטו וכימות של חריגות פתולוגיות שיכולות לנבוע מבעיות במהלך סמיטוגנזה (למשל, היתוך עצם ועקמת)13,21,222. לבסוף, אנו ממחישים את כוחם של שחזורי הדמיה תלת-ממדית במחקר ובהוראת פילוח חוליות והארכה צירית.
Protocol
Representative Results
Discussion
התארכות צירית וסגמנטציה הם שניים מהתהליכים המורכבים והדינמיים ביותר המתרחשים במהלך התפתחות עוברית של חוליות. השימוש בהדמיה תלת-ממדית ו-4D עם מעקב אחר תאים חד-תאיים הוחל, מזה זמן מה, כדי לחקור תהליכים אלה הן בעוברי זברה והן בעוברי עוף, אשר תנאי הנגישות והתרביות מאפשרים הדמיה מורכבת 19,44,44,45,46,4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאוליבייה Pourquié ואלכסנדר Aulehla על זן הכתב LuVeLu, מעבדת SunJin עבור מדגם הבדיקה RapiClear, הוגו Pereira על העזרה באמצעות BigStitcher, נונו Granjeiro על שעזר להקים את מנגנון ההדמיה החיה, מתקן בעלי החיים IGC וחברים בעבר ובהווה של מעבדת מאלו עבור הערות שימושיות ותמיכה במהלך עבודה זו.
אנו מודים על התמיכה הטכנית של מתקן ההדמיה המתקדם של IGC, הנתמך על ידי נציג המימון הפורטוגלי# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 ו- ref# PTDC/ BII-BTI/32375/2017, במימון משותף של תוכנית התפעול האזורית של Lisboa (Lisboa 2020), במסגרת הסכם השותפות של פורטוגל 2020, באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (FEDER) ו- Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, פורטוגל). העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי מענקים LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, פורטוגל) ו SCML-MC-60-2014 (סנטה קאסה דה מיסריקורדיה, פורטוגל) ל- M.M., תשתית המחקר קונג’נטו, פרויקט LISBOA-01-0145-FEDER-022170, ואת מלגת הדוקטורט PD / BD / 128426 / 2017 ל- A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
References
- Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
- Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
- Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
- Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
- Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
- Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
- de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
- Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
- Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
- Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
- Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
- Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
- McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
- Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
- Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
- Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
- Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
- Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
- Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
- Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
- Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
- Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
- Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
- Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
- . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
- . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
- Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
- Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
- Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
- Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
- Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
- Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
- Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
- Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
- Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
- Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
- Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).
