Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados
Summary
Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.
Abstract
La somitogénesis es un sello distintivo del desarrollo embrionario de vertebrados. Durante años, los investigadores han estado estudiando este proceso en una variedad de organismos utilizando una amplia gama de técnicas que abarcan enfoques ex vivo e in vitro. Sin embargo, la mayoría de los estudios aún se basan en el análisis de datos de imágenes bidimensionales (2D), lo que limita la evaluación adecuada de un proceso de desarrollo como la extensión axial y la somitogénesis que involucra interacciones altamente dinámicas en un espacio 3D complejo. Aquí describimos técnicas que permiten la adquisición de imágenes en vivo con ratones, el procesamiento de conjuntos de datos, la visualización y el análisis en 3D y 4D para estudiar las células (por ejemplo, progenitores neuromesodérmicos) involucradas en estos procesos de desarrollo. También proporcionamos un protocolo paso a paso para la tomografía de proyección óptica y la microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo en embriones de ratón (desde la preparación de la muestra hasta la adquisición de imágenes) y mostramos una tubería que desarrollamos para procesar y visualizar datos de imágenes 3D. Ampliamos el uso de algunas de estas técnicas y destacamos las características específicas de diferentes software disponibles (por ejemplo, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que se pueden utilizar para mejorar nuestra comprensión actual de la extensión axial y la formación de somita (por ejemplo, reconstrucciones 3D). En conjunto, las técnicas aquí descritas enfatizan la importancia de la visualización y el análisis de datos 3D en la biología del desarrollo, y podrían ayudar a otros investigadores a abordar mejor los datos de imágenes 3D y 4D en el contexto de la extensión y segmentación axial de vertebrados. Finalmente, el trabajo también emplea herramientas novedosas para facilitar la enseñanza del desarrollo embrionario de vertebrados.
Introduction
La formación del eje del cuerpo de los vertebrados es un proceso altamente complejo y dinámico que ocurre durante el desarrollo embrionario. Al final de la gastrulación [en el ratón, alrededor del día embrionario (E) 8.0], un grupo de células progenitoras de epiblastos conocidas como progenitores neuromesodérmicos (NMP) se convierten en un impulsor clave de la extensión axial en una secuencia de cabeza a cola, generando el tubo neural y los tejidos mesodérmicos paraxiales durante la formación del cuello, el tronco y la cola 1,2,3,4 . Curiosamente, la posición que ocupan estas NMPs en el epiblasto caudal parece jugar un papel clave en la decisión de diferenciarse en mesodermo o neuroectodermo5. Aunque actualmente carecemos de una huella molecular precisa para las NMP, generalmente se cree que estas células coexpresan T (Brachyury) y Sox2 5,6. Los mecanismos exactos que regulan las decisiones de destino de NMP (es decir, si toman rutas neuronales o mesodérmicas) solo están comenzando a definirse con precisión. La expresión de Tbx6 en la región de la raya primitiva es un marcador temprano de la decisión del destino de NMP, ya que este gen está involucrado en la inducción y especificación del mesodermo 6,7. Curiosamente, las células del mesodermo temprano parecen expresar altos niveles de Epha18, y la señalización Wnt /β-catenina, así como Msgn1 también se demostró que juegan un papel importante en la diferenciación del mesodermo paraxial y la formación de somita 9,10. Un análisis espacio-temporal completo de las NMP a nivel de una sola célula será sin duda fundamental para comprender completamente los mecanismos moleculares que controlan la especificación del mesodermo.
La formación de somitas (precursores de vértebras) es una característica clave de los vertebrados. Durante el alargamiento axial, el mesodermo paraxial se segmenta en una serie de unidades de repetición bilaterales conocidas como somitas. El número de somitas y el tiempo requerido para la formación de nuevos segmentos varía entre las especies11,12. La somitogénesis implica oscilaciones de señalización periódicas (conocidas como el “reloj de segmentación”) que pueden observarse mediante la expresión cíclica de varios genes de las vías de señalización Notch, Wnt y Fgf en el mesodermo presómtico (por ejemplo, Lfng)11,12. El modelo actual de somitogénesis también postula la existencia de un “frente de onda de maduración”, una serie de gradientes de señalización complejos que involucran señalización Fgf, Wnt y ácido retinoico que definen la posición del borde posterior de cada nuevo somita. Por lo tanto, una interacción coordinada entre el “reloj de segmentación” y el “frente de onda de maduración” es fundamental para la generación de estos módulos precursores de vértebras, ya que las perturbaciones en estos procesos morfogenéticos clave pueden resultar en letalidad embrionaria o en la formación de malformaciones congénitas (por ejemplo, escoliosis)13,14,15.
A pesar de los avances recientes sustanciales en técnicas de imagen, métodos de análisis de bioimagen y software, la mayoría de los estudios de alargamiento axial y somitogénesis todavía se basan en datos de imágenes bidimensionales individuales / aisladas (por ejemplo, secciones), lo que no permite una visualización completa del tejido multidimensional y complica la clara diferenciación entre malformaciones patológicas (es decir, debido a mutaciones) vs variación morfológica normal que ocurre durante el desarrollo embrionario16 . La imagen en 3D ya ha descubierto nuevos movimientos morfogenéticos, previamente no identificados por los métodos 2D estándar 17,18,19,20, destacando el poder de las imágenes in toto para comprender los mecanismos de la somitogénesis de vertebrados y la extensión axial.
La microscopía 3D y 4D de embriones de ratón, particularmente las imágenes en vivo, son técnicamente desafiantes y requieren pasos críticos durante la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes y el preprocesamiento de datos para permitir un análisis espacio-temporal preciso y significativo. Aquí, describimos un protocolo detallado para imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de embriones de ratón, que se puede utilizar para estudiar tanto las NMP como las células mesodérmicas durante la extensión y segmentación axial. Además, también describimos un protocolo para la tomografía de proyección óptica (OPT) de embriones y fetos más viejos, que permite la visualización y cuantificación 3D de anomalías patológicas que pueden resultar de problemas durante la somitogénesis (por ejemplo, fusión ósea y escoliosis)13,21,22. Finalmente, ilustramos el poder de las reconstrucciones por imágenes 3D en el estudio y la enseñanza de la segmentación de vertebrados y el alargamiento axial.
Protocol
Representative Results
Discussion
La elongación axial y la segmentación son dos de los procesos más complejos y dinámicos que ocurren durante el desarrollo embrionario de los vertebrados. El uso de imágenes 3D y 4D con seguimiento unicelular se ha aplicado, desde hace algún tiempo, para estudiar estos procesos tanto en embriones de pez cebra como de pollo, para lo cual la accesibilidad y las condiciones de cultivo facilitan la obtención de imágenes complejas 19,44,45,46,47,48,49 </su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Olivier Pourquié y Alexander Aulehla por la cepa reportera LuVeLu, al laboratorio SunJin para la muestra de prueba RapiClear, a Hugo Pereira por la ayuda utilizando BigStitcher, a Nuno Granjeiro por ayudar a configurar el aparato de imágenes en vivo, a la instalación de animales IGC y a los miembros pasados y presentes del laboratorio Mallo por sus útiles comentarios y apoyo durante el curso de este trabajo.
Agradecemos el apoyo técnico del Advanced Imaging Facility del CIG, que cuenta con el apoyo de la financiación portuguesa ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 y ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinanciada por el Programa Operativo Regional de Lisboa (Lisboa 2020), en el marco del Acuerdo de Asociación Portugal 2020, a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). El trabajo descrito en este manuscrito fue apoyado por las subvenciones LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) y SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) a M.M., la infraestructura de investigación Congento, proyecto LISBOA-01-0145-FEDER-022170, y la beca de doctorado PD/BD/128426/2017 a A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
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