Summary

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Published: February 28, 2021
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Summary

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Abstract

La somitogénesis es un sello distintivo del desarrollo embrionario de vertebrados. Durante años, los investigadores han estado estudiando este proceso en una variedad de organismos utilizando una amplia gama de técnicas que abarcan enfoques ex vivo e in vitro. Sin embargo, la mayoría de los estudios aún se basan en el análisis de datos de imágenes bidimensionales (2D), lo que limita la evaluación adecuada de un proceso de desarrollo como la extensión axial y la somitogénesis que involucra interacciones altamente dinámicas en un espacio 3D complejo. Aquí describimos técnicas que permiten la adquisición de imágenes en vivo con ratones, el procesamiento de conjuntos de datos, la visualización y el análisis en 3D y 4D para estudiar las células (por ejemplo, progenitores neuromesodérmicos) involucradas en estos procesos de desarrollo. También proporcionamos un protocolo paso a paso para la tomografía de proyección óptica y la microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo en embriones de ratón (desde la preparación de la muestra hasta la adquisición de imágenes) y mostramos una tubería que desarrollamos para procesar y visualizar datos de imágenes 3D. Ampliamos el uso de algunas de estas técnicas y destacamos las características específicas de diferentes software disponibles (por ejemplo, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que se pueden utilizar para mejorar nuestra comprensión actual de la extensión axial y la formación de somita (por ejemplo, reconstrucciones 3D). En conjunto, las técnicas aquí descritas enfatizan la importancia de la visualización y el análisis de datos 3D en la biología del desarrollo, y podrían ayudar a otros investigadores a abordar mejor los datos de imágenes 3D y 4D en el contexto de la extensión y segmentación axial de vertebrados. Finalmente, el trabajo también emplea herramientas novedosas para facilitar la enseñanza del desarrollo embrionario de vertebrados.

Introduction

La formación del eje del cuerpo de los vertebrados es un proceso altamente complejo y dinámico que ocurre durante el desarrollo embrionario. Al final de la gastrulación [en el ratón, alrededor del día embrionario (E) 8.0], un grupo de células progenitoras de epiblastos conocidas como progenitores neuromesodérmicos (NMP) se convierten en un impulsor clave de la extensión axial en una secuencia de cabeza a cola, generando el tubo neural y los tejidos mesodérmicos paraxiales durante la formación del cuello, el tronco y la cola 1,2,3,4 . Curiosamente, la posición que ocupan estas NMPs en el epiblasto caudal parece jugar un papel clave en la decisión de diferenciarse en mesodermo o neuroectodermo5. Aunque actualmente carecemos de una huella molecular precisa para las NMP, generalmente se cree que estas células coexpresan T (Brachyury) y Sox2 5,6. Los mecanismos exactos que regulan las decisiones de destino de NMP (es decir, si toman rutas neuronales o mesodérmicas) solo están comenzando a definirse con precisión. La expresión de Tbx6 en la región de la raya primitiva es un marcador temprano de la decisión del destino de NMP, ya que este gen está involucrado en la inducción y especificación del mesodermo 6,7. Curiosamente, las células del mesodermo temprano parecen expresar altos niveles de Epha18, y la señalización Wnt /β-catenina, así como Msgn1 también se demostró que juegan un papel importante en la diferenciación del mesodermo paraxial y la formación de somita 9,10. Un análisis espacio-temporal completo de las NMP a nivel de una sola célula será sin duda fundamental para comprender completamente los mecanismos moleculares que controlan la especificación del mesodermo.

La formación de somitas (precursores de vértebras) es una característica clave de los vertebrados. Durante el alargamiento axial, el mesodermo paraxial se segmenta en una serie de unidades de repetición bilaterales conocidas como somitas. El número de somitas y el tiempo requerido para la formación de nuevos segmentos varía entre las especies11,12. La somitogénesis implica oscilaciones de señalización periódicas (conocidas como el “reloj de segmentación”) que pueden observarse mediante la expresión cíclica de varios genes de las vías de señalización Notch, Wnt y Fgf en el mesodermo presómtico (por ejemplo, Lfng)11,12. El modelo actual de somitogénesis también postula la existencia de un “frente de onda de maduración”, una serie de gradientes de señalización complejos que involucran señalización Fgf, Wnt y ácido retinoico que definen la posición del borde posterior de cada nuevo somita. Por lo tanto, una interacción coordinada entre el “reloj de segmentación” y el “frente de onda de maduración” es fundamental para la generación de estos módulos precursores de vértebras, ya que las perturbaciones en estos procesos morfogenéticos clave pueden resultar en letalidad embrionaria o en la formación de malformaciones congénitas (por ejemplo, escoliosis)13,14,15.

A pesar de los avances recientes sustanciales en técnicas de imagen, métodos de análisis de bioimagen y software, la mayoría de los estudios de alargamiento axial y somitogénesis todavía se basan en datos de imágenes bidimensionales individuales / aisladas (por ejemplo, secciones), lo que no permite una visualización completa del tejido multidimensional y complica la clara diferenciación entre malformaciones patológicas (es decir, debido a mutaciones) vs variación morfológica normal que ocurre durante el desarrollo embrionario16 . La imagen en 3D ya ha descubierto nuevos movimientos morfogenéticos, previamente no identificados por los métodos 2D estándar 17,18,19,20, destacando el poder de las imágenes in toto para comprender los mecanismos de la somitogénesis de vertebrados y la extensión axial.

La microscopía 3D y 4D de embriones de ratón, particularmente las imágenes en vivo, son técnicamente desafiantes y requieren pasos críticos durante la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes y el preprocesamiento de datos para permitir un análisis espacio-temporal preciso y significativo. Aquí, describimos un protocolo detallado para imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de embriones de ratón, que se puede utilizar para estudiar tanto las NMP como las células mesodérmicas durante la extensión y segmentación axial. Además, también describimos un protocolo para la tomografía de proyección óptica (OPT) de embriones y fetos más viejos, que permite la visualización y cuantificación 3D de anomalías patológicas que pueden resultar de problemas durante la somitogénesis (por ejemplo, fusión ósea y escoliosis)13,21,22. Finalmente, ilustramos el poder de las reconstrucciones por imágenes 3D en el estudio y la enseñanza de la segmentación de vertebrados y el alargamiento axial.

Protocol

Los experimentos con animales siguieron las legislaciones portuguesa (Portaria 1005/92) y europea (Directiva 2010/63 / UE) sobre vivienda, cría y bienestar. El proyecto fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Instituto Gulbenkian de Ciência y por la Entidad Nacional Portuguesa, “Direcção Geral de Alimentação e Veterinária” (referencia de la licencia: 014308). 1. Preparación de muestras para imágenes 3D y 4D NOTA: Aquí proporcionamos una descripc…

Representative Results

Los resultados representativos mostrados en este trabajo tanto para la imagen viva como para la inmunofluorescencia, se obtuvieron utilizando un sistema de dos fotones, con un objetivo de agua de 20 × 1.0 NA, el láser de excitación sintonizado a 960 nm y fotodetectores GaAsP (como se describe en Dias et al. (2020)43. La tomografía de proyección óptica se realizó utilizando un escáner OPenT personalizado (como se describe en Gualda et al. (2013)28. <p class="jove…

Discussion

La elongación axial y la segmentación son dos de los procesos más complejos y dinámicos que ocurren durante el desarrollo embrionario de los vertebrados. El uso de imágenes 3D y 4D con seguimiento unicelular se ha aplicado, desde hace algún tiempo, para estudiar estos procesos tanto en embriones de pez cebra como de pollo, para lo cual la accesibilidad y las condiciones de cultivo facilitan la obtención de imágenes complejas 19,44,45,46,47,48,49 </su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Olivier Pourquié y Alexander Aulehla por la cepa reportera LuVeLu, al laboratorio SunJin para la muestra de prueba RapiClear, a Hugo Pereira por la ayuda utilizando BigStitcher, a Nuno Granjeiro por ayudar a configurar el aparato de imágenes en vivo, a la instalación de animales IGC y a los miembros pasados y presentes del laboratorio Mallo por sus útiles comentarios y apoyo durante el curso de este trabajo.

Agradecemos el apoyo técnico del Advanced Imaging Facility del CIG, que cuenta con el apoyo de la financiación portuguesa ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 y ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinanciada por el Programa Operativo Regional de Lisboa (Lisboa 2020), en el marco del Acuerdo de Asociación Portugal 2020, a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). El trabajo descrito en este manuscrito fue apoyado por las subvenciones LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) y SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) a M.M., la infraestructura de investigación Congento, proyecto LISBOA-01-0145-FEDER-022170, y la beca de doctorado PD/BD/128426/2017 a A.D.

Materials

Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20×20 mm #0 (any) 100um thick
Coverglass 20×20 mm #1 (any) 170um thick
Coverglass 20×60 mm #1.5 (any) To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft Commerial software tool
Slide, depression concave glass – 75×25 mm (any) To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

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Cite This Article
Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

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