Summary

نهج التصور والتحليل ثلاثي ورباعي الأبعاد لدراسة الاستطالة المحورية الفقارية وتجزئتها

Published: February 28, 2021
doi:

Summary

هنا ، نصف الأدوات والأساليب الحسابية التي تسمح بتصور وتحليل بيانات الصور ثلاثية ورباعية الأبعاد لأجنة الفئران في سياق الاستطالة المحورية والتقسيم ، والتي تم الحصول عليها عن طريق التصوير المقطعي بالإسقاط البصري ، وعن طريق التصوير الحي وتلطيخ التألق المناعي الكامل باستخدام المجهر متعدد الفوتونات.

Abstract

Somitogenesis هو السمة المميزة للتطور الجنيني الفقاري. لسنوات ، كان الباحثون يدرسون هذه العملية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية باستخدام مجموعة واسعة من التقنيات التي تشمل النهج خارج الجسم الحي وفي المختبر. ومع ذلك ، لا تزال معظم الدراسات تعتمد على تحليل بيانات التصوير ثنائية الأبعاد (2D) ، مما يحد من التقييم السليم لعملية تنموية مثل الامتداد المحوري وتكوين السوميتوجينيسيس التي تنطوي على تفاعلات ديناميكية للغاية في مساحة 3D معقدة. هنا نصف التقنيات التي تسمح للفأر بالحصول على التصوير الحي ، ومعالجة مجموعة البيانات ، والتصور والتحليل في 3D و 4D لدراسة الخلايا (على سبيل المثال ، أسلاف الجلد المتوسط العصبي) المشاركة في هذه العمليات التنموية. كما نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري والمجهر المناعي الكامل في أجنة الفئران (من إعداد العينات إلى الحصول على الصور) ونظهر خط أنابيب قمنا بتطويره لمعالجة وتصور بيانات صورة 3D. نحن نوسع نطاق استخدام بعض هذه التقنيات ونسلط الضوء على ميزات محددة لمختلف البرامج المتاحة (على سبيل المثال ، فيجي / ImageJ ، Drishti ، Amira و Imaris) التي يمكن استخدامها لتحسين فهمنا الحالي للامتداد المحوري وتشكيل somite (على سبيل المثال ، إعادة بناء 3D). بشكل عام ، تؤكد التقنيات الموصوفة هنا على أهمية تصور وتحليل البيانات ثلاثية الأبعاد في البيولوجيا التنموية ، وقد تساعد الباحثين الآخرين على معالجة بيانات الصور ثلاثية الأبعاد و 4D بشكل أفضل في سياق الامتداد المحوري للفقاريات وتجزئتها. وأخيرا، يستخدم العمل أيضا أدوات جديدة لتسهيل تعليم التطور الجنيني للفقاريات.

Introduction

تشكيل محور جسم الفقاريات هو عملية معقدة للغاية وديناميكية تحدث أثناء التطور الجنيني. في نهاية عملية المعدة [في الفأر ، حول اليوم الجنيني (E) 8.0] ، تصبح مجموعة من الخلايا السلفية الفوقية المعروفة باسم أسلاف الجلد المتوسط العصبي (NMPs) محركا رئيسيا للامتداد المحوري في تسلسل الرأس إلى الذيل ، مما يولد الأنبوب العصبي وأنسجة الجلد المتوسط الباراكسي أثناء تكوين الرقبة والجذع والذيل1،2،3،4 . ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن الموقع الذي تشغله هذه NMPs في الأرومة الذيلية يلعب دورا رئيسيا في قرار التمايز إلى الأديم المتوسط أو الأديم العصبي5. على الرغم من أننا نفتقر حاليا إلى بصمة جزيئية دقيقة ل NMPs ، إلا أنه يعتقد عموما أن هذه الخلايا تشترك في التعبير عن T (Brachyury) و Sox2 5,6. الآليات الدقيقة التي تنظم قرارات مصير NMP (أي ما إذا كانت تتخذ طرقا عصبية أو متوسطة الجلد) بدأت فقط في التحديد بدقة. تعبير Tbx6 في منطقة الخط البدائي هو علامة مبكرة على قرار مصير NMP ، حيث يشارك هذا الجين في تحريض ومواصفات الأديم المتوسط 6,7. ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن خلايا الأديم المتوسط المبكرة تعبر عن مستويات عالية من Epha18 ، وإشارات Wnt / β-catenin ، وكذلك Msgn1 ، كما تبين أنها تلعب أدوارا مهمة في تمايز الأديم المتوسط الباراكسي وتكوين السوميت 9,10. من المؤكد أن التحليل المكاني الزماني الكامل ل NMPs على مستوى خلية واحدة سيكون مفيدا لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في مواصفات الأديم المتوسط بشكل كامل.

تشكيل سوميت (سلائف الفقرات) هو سمة رئيسية من سمات الفقاريات. أثناء الاستطالة المحورية ، يصبح الأديم المتوسط الباراكسالي مجزأ في سلسلة من الوحدات المتكررة الثنائية المعروفة باسم somites. يختلف عدد السوميت والوقت اللازم لتشكيل شرائح جديدة بين الأنواع11,12. يتضمن تكوين السوميتوجينيسيس تذبذبات إشارات دورية (تعرف باسم “ساعة التجزئة”) يمكن ملاحظتها من خلال التعبير الدوري لعدة جينات من مسارات إشارات Notch و Wnt و Fgf في الأديم المتوسط قبل الوهمي (على سبيل المثال ، Lfng) 11,12. يفترض النموذج الحالي لتكوين السوميتوجينيسيس أيضا وجود “جبهة موجية للنضج” ، وهي سلسلة من تدرجات الإشارات المعقدة التي تنطوي على إشارات Fgf و Wnt وحمض الريتينويك التي تحدد موضع الحدود الخلفية لكل سوميت جديد. ولذلك فإن التفاعل المنسق بين “ساعة التجزئة” و “الجبهة الموجية للنضج” أمر أساسي لتوليد وحدات سلائف الفقرات هذه لأن الاضطرابات في هذه العمليات المورفوجينية الرئيسية يمكن أن تؤدي إلى الفتك الجنيني أو إلى تكوين تشوهات خلقية (مثل الجنف) 13،14،15.

على الرغم من التطورات الحديثة الكبيرة في تقنيات التصوير وطرق وبرامج تحليل الصور الحيوية ، فإن معظم دراسات الاستطالة المحورية وتكوين السميتوجينيا لا تزال تعتمد على بيانات الصور ثنائية الأبعاد المفردة / المعزولة (على سبيل المثال ، الأقسام) ، والتي لا تسمح بتصور كامل متعدد الأبعاد للأنسجة ويعقد التمييز الواضح بين التشوهات المرضية (أي بسبب الطفرات) مقابل التباين المورفولوجي الطبيعي الذي يحدث أثناء التطور الجنيني16 . وقد كشف التصوير في 3D بالفعل عن حركات مورفوجينية جديدة ، لم يتم تحديدها سابقا من خلال الطرق القياسية ثنائية الأبعاد17،18،19،20 ، مما يسلط الضوء على قوة التصوير في toto لفهم آليات تكوين الفقاريات والامتداد المحوري.

يعد الفحص المجهري 3D و 4D لأجنة الفئران ، وخاصة التصوير الحي ، تحديا تقنيا ويتطلب خطوات حاسمة أثناء إعداد العينات والحصول على الصور والمعالجة المسبقة للبيانات من أجل السماح بتحليل مكاني وزماني دقيق وذي مغزى. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للتصوير الحي وتلطيخ التألق المناعي الكامل لأجنة الفئران ، والذي يمكن استخدامه لدراسة كل من NMPs وخلايا الجلد المتوسط أثناء التمديد المحوري والتقسيم. بالإضافة إلى ذلك ، نصف أيضا بروتوكولا للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري (OPT) للأجنة والأجنة الأكبر سنا ، والذي يسمح ب 3D في تصور toto وتحديد كمية التشوهات المرضية التي يمكن أن تنتج عن مشاكل أثناء تكوين السوميتوجينيسيس (على سبيل المثال ، اندماج العظام والجنف) 13،21،22. أخيرا ، نوضح قوة إعادة بناء التصوير 3D في دراسة وتدريس تجزئة الفقاريات والاستطالة المحورية.

Protocol

اتبعت التجارب التي شملت الحيوانات التشريعات البرتغالية (Portaria 1005/92) والأوروبية (التوجيه 2010/63/EU) المتعلقة بالإسكان والتربية والرعاية الاجتماعية. وقد استعرضت المشروع ووافقت عليه لجنة الأخلاقيات التابعة ل “معهد غولبنكيان دي سينسيا” والكيان الوطني البرتغالي “Direcção Geral de Alimentação e Veterinária” (مرجع ا…

Representative Results

تم الحصول على النتائج التمثيلية الموضحة في هذه الورقة لكل من التصوير الحي والتألق المناعي ، باستخدام نظام ثنائي الفوتون ، مع هدف مائي 20 × 1.0 NA ، وليزر الإثارة مضبوط إلى 960 نانومتر ، وأجهزة الكشف الضوئي GaAsP (كما هو موضح في Dias et al. (2020)43. تم إجراء التصوير المقطعي بالإسقاط البصري باست…

Discussion

الاستطالة المحورية والتقسيم هما من أكثر العمليات تعقيدا وديناميكية التي تحدث أثناء التطور الجنيني للفقاريات. تم تطبيق استخدام التصوير ثلاثي الأبعاد و 4D مع تتبع خلية واحدة ، لبعض الوقت ، لدراسة هذه العمليات في كل من أجنة الزرد والدجاج ، والتي تسهل ظروف الوصول إليها واستزراعها التصوير الم?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر أوليفييه بوركييه وألكسندر أوليهلا على سلالة مراسل LuVeLu ، ومختبر SunJin لعينة اختبار RapiClear ، وهوغو بيريرا على المساعدة في استخدام BigStitcher ، ونونو غرانجيرو للمساعدة في إعداد جهاز التصوير الحي ، ومرفق الحيوانات التابع للجنة الحكومية الدولية والأعضاء السابقين والحاليين في مختبر Mallo للحصول على تعليقات ودعم مفيدين خلال هذا العمل.

ونشكر الدعم التقني المقدم من مرفق التصوير المتقدم التابع للجنة الحكومية الدولية، والذي يدعمه التمويل البرتغالي المرجع #PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 والمرجع رقم PTDC/BII-BTI/32375/2017، الذي يشترك في تمويله برنامج لشبونة التشغيلي الإقليمي (لشبونة 2020)، بموجب اتفاق الشراكة البرتغالي لعام 2020، من خلال الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (FEDER) ومؤسسة العلوم والتكنولوجيا (FCT، البرتغال). تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة من خلال منح LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT، البرتغال) و SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia، البرتغال) إلى M.M.، والبنية التحتية البحثية Congento، ومشروع LISBOA-01-0145-FEDER-022170، وزمالة الدكتوراه PD/BD/128426/2017 إلى A.D.

Materials

Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20×20 mm #0 (any) 100um thick
Coverglass 20×20 mm #1 (any) 170um thick
Coverglass 20×60 mm #1.5 (any) To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft Commerial software tool
Slide, depression concave glass – 75×25 mm (any) To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

References

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
  41. . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
  42. . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).

Play Video

Cite This Article
Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

View Video