Drei- und vierdimensionale Visualisierungs- und Analyseansätze zur Untersuchung der axialen Dehnung und Segmentierung von Wirbeltieren
Summary
Hier beschreiben wir Berechnungswerkzeuge und -methoden, die die Visualisierung und Analyse von drei- und vierdimensionalen Bilddaten von Mausembryonen im Rahmen der axialen Dehnung und Segmentierung ermöglichen, die durch optische In-toto-Projektionstomographie und durch Live-Bildgebung und Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung mittels Multiphotonenmikroskopie erhalten werden.
Abstract
Die Somitogenese ist ein Kennzeichen der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren. Seit Jahren untersuchen Forscher diesen Prozess in einer Vielzahl von Organismen mit einer breiten Palette von Techniken, die Ex-vivo- und In-vitro-Ansätze umfassen. Die meisten Studien stützen sich jedoch immer noch auf die Analyse zweidimensionaler (2D) Bilddaten, was die ordnungsgemäße Bewertung eines Entwicklungsprozesses wie axiale Ausdehnung und Somitogenese mit hochdynamischen Wechselwirkungen in einem komplexen 3D-Raum einschränkt. Hier beschreiben wir Techniken, die die Live-Bildgebung der Maus, die Datensatzverarbeitung, die Visualisierung und die Analyse in 3D und 4D ermöglichen, um die Zellen (z. B. neuromesodermale Vorläufer) zu untersuchen, die an diesen Entwicklungsprozessen beteiligt sind. Wir bieten auch ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die optische Projektionstomographie und die gesamte Immunfluoreszenzmikroskopie in Mausembryonen (von der Probenvorbereitung bis zur Bildaufnahme) und zeigen eine Pipeline, die wir entwickelt haben, um 3D-Bilddaten zu verarbeiten und zu visualisieren. Wir erweitern den Einsatz einiger dieser Techniken und heben spezifische Merkmale verschiedener verfügbarer Software (z. B. Fidschi / ImageJ, Drishti, Amira und Imaris) hervor, die verwendet werden können, um unser derzeitiges Verständnis von axialer Ausdehnung und Somitbildung (z. B. 3D-Rekonstruktionen) zu verbessern. Insgesamt betonen die hier beschriebenen Techniken die Bedeutung der 3D-Datenvisualisierung und -analyse in der Entwicklungsbiologie und könnten anderen Forschern helfen, 3D- und 4D-Bilddaten im Zusammenhang mit der axialen Ausdehnung und Segmentierung von Wirbeltieren besser zu adressieren. Schließlich verwendet die Arbeit auch neuartige Werkzeuge, um die embryonale Entwicklung von Wirbeltieren zu erleichtern.
Introduction
Die Bildung von Wirbelkörperachsen ist ein hochkomplexer und dynamischer Prozess, der während der Embryonalentwicklung stattfindet. Am Ende der Gastrulation [in der Maus, um den Embryonaltag (E) 8.0] wird eine Gruppe von Epiblast-Vorläuferzellen, die als neuromesodermale Vorläuferzellen (NMPs) bekannt sind, zu einem Schlüsseltreiber der axialen Ausdehnung in einer Kopf-zu-Schwanz-Sequenz und erzeugt das Neuralrohr und das paraxiale mesodermale Gewebe während der Hals-, Rumpf- und Schwanzbildung 1,2,3,4 . Interessanterweise scheint die Position, die diese NMPs im kaudalen Epiblasten einnehmen, eine Schlüsselrolle bei der Entscheidung zu spielen, in Mesoderm oder Neuroektoderm5 zu differenzieren. Obwohl uns derzeit ein präziser molekularer Fingerabdruck für NMPs fehlt, wird allgemein angenommen, dass diese Zellen T (Brachyury) und Sox2 5,6 koexprimieren. Die genauen Mechanismen, die NMP-Schicksalsentscheidungen regulieren (d.h. ob sie neuronale oder mesodermale Routen nehmen), beginnen erst jetzt genau definiert zu werden. Die Tbx6-Expression im primitiven Streifenbereich ist ein früher Marker für die NMP-Schicksalsentscheidung, da dieses Gen an der Induktion und Spezifikation von Mesoderm 6,7 beteiligt ist. Interessanterweise scheinen frühe Mesodermzellen hohe Konzentrationen von Epha18 zu exprimieren, und es wurde auch gezeigt, dass die Wnt/β-Catenin-Signalgebung sowie Msgn1 eine wichtige Rolle bei der paraxialen Mesodermdifferenzierung und der Somitbildung spielen 9,10. Eine vollständige räumlich-zeitliche Analyse von NMPs auf Einzelzellebene wird sicherlich entscheidend sein, um die molekularen Mechanismen, die die Mesoderm-Spezifikation steuern, vollständig zu verstehen.
Die Bildung von Somiten (Wirbelvorläufern) ist ein Schlüsselmerkmal von Wirbeltieren. Während der axialen Dehnung wird das paraxiale Mesoderm in eine Reihe von bilateralen sich wiederholenden Einheiten segmentiert, die als Somiten bezeichnet werden. Die Anzahl der Somiten und die Zeit, die für die Bildung neuer Segmente benötigt wird, variieren zwischen den Arten11,12. Somitogenese beinhaltet periodische Signalschwingungen (bekannt als “Segmentierungsuhr”), die durch die zyklische Expression mehrerer Gene der Signalwege Notch, Wnt und Fgf im präsomitischen Mesoderm (z. B. Lfng) beobachtet werden können11,12. Das aktuelle Modell der Somitogenese postuliert auch die Existenz einer “Reifungswellenfront”, einer Reihe komplexer Signalgradienten mit Fgf-, Wnt- und Retinsäuresignalen, die die Position der hinteren Grenze jedes neuen Somits definieren. Eine koordinierte Wechselwirkung zwischen der “Segmentierungsuhr” und der “Reifungswellenfront” ist daher für die Erzeugung dieser Wirbelvorläufermodule von grundlegender Bedeutung, da Störungen in diesen wichtigen morphogenetischen Prozessen zu embryonaler Letalität oder zur Bildung angeborener Fehlbildungen (z.B. Skoliose) führen können)13,14,15.
Trotz erheblicher Fortschritte in jüngster Zeit bei bildgebenden Verfahren, Biobildanalysemethoden und Software stützen sich die meisten Studien zur axialen Dehnung und Somitogenese immer noch auf ein-/isolierte zweidimensionale Bilddaten (z. B. Schnitte), die keine vollständige mehrdimensionale Gewebevisualisierung ermöglichen und eine klare Unterscheidung zwischen pathologischen Fehlbildungen (d. H. Aufgrund von Mutationen) gegenüber normalen morphologischen Variationen während der Embryonalentwicklung erschweren16 . Die Bildgebung in 3D hat bereits neuartige morphogenetische Bewegungen aufgedeckt, die zuvor nicht durch Standard-2D-Methodenidentifiziert wurden 17,18,19,20, was die Leistungsfähigkeit der In-toto-Bildgebung unterstreicht, die Mechanismen der Wirbeltier-Somitogenese und der axialen Ausdehnung zu verstehen.
Die 3D- und 4D-Mikroskopie von Mausembryonen, insbesondere die Live-Bildgebung, ist technisch anspruchsvoll und erfordert kritische Schritte während der Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenvorverarbeitung, um eine genaue und aussagekräftige räumlich-zeitliche Analyse zu ermöglichen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Live-Bildgebung und die Ganz-Mount-Immunfluoreszenzfärbung von Mausembryonen, mit dem sowohl NMPs als auch mesodermale Zellen während der axialen Ausdehnung und Segmentierung untersucht werden können. Darüber hinaus beschreiben wir auch ein Protokoll für die optische Projektionstomographie (OPT) älterer Embryonen und Föten, das eine 3D-in-toto-Visualisierung und Quantifizierung von pathologischen Anomalien ermöglicht, die sich aus Problemen während der Somitogenese (z. B. Knochenfusion und Skoliose) ergeben können)13,21,22. Schließlich veranschaulichen wir die Leistungsfähigkeit von 3D-Bildgebungsrekonstruktionen in Studium und Lehre der Wirbeltiersegmentierung und axialen Dehnung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Axiale Dehnung und Segmentierung sind zwei der komplexesten und dynamischsten Prozesse, die während der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren auftreten. Die Verwendung von 3D- und 4D-Bildgebung mit Einzelzellverfolgung wird seit einiger Zeit angewendet, um diese Prozesse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Hühnerembryonen zu untersuchen, für die Zugänglichkeit und Kulturbedingungen eine komplexe Bildgebung ermöglichen 19,44,45,46,47,48,49 <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Olivier Pourquié und Alexander Aulehla für den LuVeLu-Reporterstamm, dem SunJin-Labor für das RapiClear-Testmuster, Hugo Pereira für die Hilfe bei der Verwendung von BigStitcher, Nuno Granjeiro für die Hilfe bei der Einrichtung des Live-Imaging-Apparates, der IGC-Tieranlage und ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Mallo-Labors für nützliche Kommentare und Unterstützung während dieser Arbeit.
Wir danken der technischen Unterstützung der Advanced Imaging Facility der IGC, die durch portugiesische Mittel unterstützt wird ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 und ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, kofinanziert durch das Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), im Rahmen des Partnerschaftsabkommens Portugal 2020, durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) und Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Die in diesem Manuskript beschriebenen Arbeiten wurden durch die Zuschüsse LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) und SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) an M.M., die Forschungsinfrastruktur Congento, das Projekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170 und das PhD-Stipendium PD/BD/128426/2017 an A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
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