Summary

Drei- und vierdimensionale Visualisierungs- und Analyseansätze zur Untersuchung der axialen Dehnung und Segmentierung von Wirbeltieren

Published: February 28, 2021
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Summary

Hier beschreiben wir Berechnungswerkzeuge und -methoden, die die Visualisierung und Analyse von drei- und vierdimensionalen Bilddaten von Mausembryonen im Rahmen der axialen Dehnung und Segmentierung ermöglichen, die durch optische In-toto-Projektionstomographie und durch Live-Bildgebung und Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung mittels Multiphotonenmikroskopie erhalten werden.

Abstract

Die Somitogenese ist ein Kennzeichen der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren. Seit Jahren untersuchen Forscher diesen Prozess in einer Vielzahl von Organismen mit einer breiten Palette von Techniken, die Ex-vivo- und In-vitro-Ansätze umfassen. Die meisten Studien stützen sich jedoch immer noch auf die Analyse zweidimensionaler (2D) Bilddaten, was die ordnungsgemäße Bewertung eines Entwicklungsprozesses wie axiale Ausdehnung und Somitogenese mit hochdynamischen Wechselwirkungen in einem komplexen 3D-Raum einschränkt. Hier beschreiben wir Techniken, die die Live-Bildgebung der Maus, die Datensatzverarbeitung, die Visualisierung und die Analyse in 3D und 4D ermöglichen, um die Zellen (z. B. neuromesodermale Vorläufer) zu untersuchen, die an diesen Entwicklungsprozessen beteiligt sind. Wir bieten auch ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die optische Projektionstomographie und die gesamte Immunfluoreszenzmikroskopie in Mausembryonen (von der Probenvorbereitung bis zur Bildaufnahme) und zeigen eine Pipeline, die wir entwickelt haben, um 3D-Bilddaten zu verarbeiten und zu visualisieren. Wir erweitern den Einsatz einiger dieser Techniken und heben spezifische Merkmale verschiedener verfügbarer Software (z. B. Fidschi / ImageJ, Drishti, Amira und Imaris) hervor, die verwendet werden können, um unser derzeitiges Verständnis von axialer Ausdehnung und Somitbildung (z. B. 3D-Rekonstruktionen) zu verbessern. Insgesamt betonen die hier beschriebenen Techniken die Bedeutung der 3D-Datenvisualisierung und -analyse in der Entwicklungsbiologie und könnten anderen Forschern helfen, 3D- und 4D-Bilddaten im Zusammenhang mit der axialen Ausdehnung und Segmentierung von Wirbeltieren besser zu adressieren. Schließlich verwendet die Arbeit auch neuartige Werkzeuge, um die embryonale Entwicklung von Wirbeltieren zu erleichtern.

Introduction

Die Bildung von Wirbelkörperachsen ist ein hochkomplexer und dynamischer Prozess, der während der Embryonalentwicklung stattfindet. Am Ende der Gastrulation [in der Maus, um den Embryonaltag (E) 8.0] wird eine Gruppe von Epiblast-Vorläuferzellen, die als neuromesodermale Vorläuferzellen (NMPs) bekannt sind, zu einem Schlüsseltreiber der axialen Ausdehnung in einer Kopf-zu-Schwanz-Sequenz und erzeugt das Neuralrohr und das paraxiale mesodermale Gewebe während der Hals-, Rumpf- und Schwanzbildung 1,2,3,4 . Interessanterweise scheint die Position, die diese NMPs im kaudalen Epiblasten einnehmen, eine Schlüsselrolle bei der Entscheidung zu spielen, in Mesoderm oder Neuroektoderm5 zu differenzieren. Obwohl uns derzeit ein präziser molekularer Fingerabdruck für NMPs fehlt, wird allgemein angenommen, dass diese Zellen T (Brachyury) und Sox2 5,6 koexprimieren. Die genauen Mechanismen, die NMP-Schicksalsentscheidungen regulieren (d.h. ob sie neuronale oder mesodermale Routen nehmen), beginnen erst jetzt genau definiert zu werden. Die Tbx6-Expression im primitiven Streifenbereich ist ein früher Marker für die NMP-Schicksalsentscheidung, da dieses Gen an der Induktion und Spezifikation von Mesoderm 6,7 beteiligt ist. Interessanterweise scheinen frühe Mesodermzellen hohe Konzentrationen von Epha18 zu exprimieren, und es wurde auch gezeigt, dass die Wnt/β-Catenin-Signalgebung sowie Msgn1 eine wichtige Rolle bei der paraxialen Mesodermdifferenzierung und der Somitbildung spielen 9,10. Eine vollständige räumlich-zeitliche Analyse von NMPs auf Einzelzellebene wird sicherlich entscheidend sein, um die molekularen Mechanismen, die die Mesoderm-Spezifikation steuern, vollständig zu verstehen.

Die Bildung von Somiten (Wirbelvorläufern) ist ein Schlüsselmerkmal von Wirbeltieren. Während der axialen Dehnung wird das paraxiale Mesoderm in eine Reihe von bilateralen sich wiederholenden Einheiten segmentiert, die als Somiten bezeichnet werden. Die Anzahl der Somiten und die Zeit, die für die Bildung neuer Segmente benötigt wird, variieren zwischen den Arten11,12. Somitogenese beinhaltet periodische Signalschwingungen (bekannt als “Segmentierungsuhr”), die durch die zyklische Expression mehrerer Gene der Signalwege Notch, Wnt und Fgf im präsomitischen Mesoderm (z. B. Lfng) beobachtet werden können11,12. Das aktuelle Modell der Somitogenese postuliert auch die Existenz einer “Reifungswellenfront”, einer Reihe komplexer Signalgradienten mit Fgf-, Wnt- und Retinsäuresignalen, die die Position der hinteren Grenze jedes neuen Somits definieren. Eine koordinierte Wechselwirkung zwischen der “Segmentierungsuhr” und der “Reifungswellenfront” ist daher für die Erzeugung dieser Wirbelvorläufermodule von grundlegender Bedeutung, da Störungen in diesen wichtigen morphogenetischen Prozessen zu embryonaler Letalität oder zur Bildung angeborener Fehlbildungen (z.B. Skoliose) führen können)13,14,15.

Trotz erheblicher Fortschritte in jüngster Zeit bei bildgebenden Verfahren, Biobildanalysemethoden und Software stützen sich die meisten Studien zur axialen Dehnung und Somitogenese immer noch auf ein-/isolierte zweidimensionale Bilddaten (z. B. Schnitte), die keine vollständige mehrdimensionale Gewebevisualisierung ermöglichen und eine klare Unterscheidung zwischen pathologischen Fehlbildungen (d. H. Aufgrund von Mutationen) gegenüber normalen morphologischen Variationen während der Embryonalentwicklung erschweren16 . Die Bildgebung in 3D hat bereits neuartige morphogenetische Bewegungen aufgedeckt, die zuvor nicht durch Standard-2D-Methodenidentifiziert wurden 17,18,19,20, was die Leistungsfähigkeit der In-toto-Bildgebung unterstreicht, die Mechanismen der Wirbeltier-Somitogenese und der axialen Ausdehnung zu verstehen.

Die 3D- und 4D-Mikroskopie von Mausembryonen, insbesondere die Live-Bildgebung, ist technisch anspruchsvoll und erfordert kritische Schritte während der Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenvorverarbeitung, um eine genaue und aussagekräftige räumlich-zeitliche Analyse zu ermöglichen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Live-Bildgebung und die Ganz-Mount-Immunfluoreszenzfärbung von Mausembryonen, mit dem sowohl NMPs als auch mesodermale Zellen während der axialen Ausdehnung und Segmentierung untersucht werden können. Darüber hinaus beschreiben wir auch ein Protokoll für die optische Projektionstomographie (OPT) älterer Embryonen und Föten, das eine 3D-in-toto-Visualisierung und Quantifizierung von pathologischen Anomalien ermöglicht, die sich aus Problemen während der Somitogenese (z. B. Knochenfusion und Skoliose) ergeben können)13,21,22. Schließlich veranschaulichen wir die Leistungsfähigkeit von 3D-Bildgebungsrekonstruktionen in Studium und Lehre der Wirbeltiersegmentierung und axialen Dehnung.

Protocol

Tierversuche folgten den portugiesischen (Portaria 1005/92) und europäischen (Richtlinie 2010/63/EU) Rechtsvorschriften über Unterkunft, Haltung und Wohlfahrt. Das Projekt wurde von der Ethikkommission des “Instituto Gulbenkian de Ciência” und von der portugiesischen Nationalstelle “Direcção Geral de Alimentação e Veterinária” (Lizenzreferenz: 014308) geprüft und genehmigt. 1. Probenvorbereitung für 3D- und 4D-Bildgebung HINWEIS: Hier finden Sie eine detaill…

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Artikel sowohl für die Live- als auch für die Immunfluoreszenzbildgebung gezeigt werden, wurden unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Systems mit einem 20 × 1,0 NA-Wasserobjektiv, dem auf 960 nm abgestimmten Anregungslaser und GaAsP-Photodetektoren (wie in Dias et al. (2020) 43 beschrieben. Die optische Projektionstomographie wurde mit einem speziell angefertigten OPenT-Scanner durchgeführt (wie in Gualda et al. (2013)28 bes…

Discussion

Axiale Dehnung und Segmentierung sind zwei der komplexesten und dynamischsten Prozesse, die während der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren auftreten. Die Verwendung von 3D- und 4D-Bildgebung mit Einzelzellverfolgung wird seit einiger Zeit angewendet, um diese Prozesse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Hühnerembryonen zu untersuchen, für die Zugänglichkeit und Kulturbedingungen eine komplexe Bildgebung ermöglichen 19,44,45,46,47,48,49 <sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Olivier Pourquié und Alexander Aulehla für den LuVeLu-Reporterstamm, dem SunJin-Labor für das RapiClear-Testmuster, Hugo Pereira für die Hilfe bei der Verwendung von BigStitcher, Nuno Granjeiro für die Hilfe bei der Einrichtung des Live-Imaging-Apparates, der IGC-Tieranlage und ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Mallo-Labors für nützliche Kommentare und Unterstützung während dieser Arbeit.

Wir danken der technischen Unterstützung der Advanced Imaging Facility der IGC, die durch portugiesische Mittel unterstützt wird ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 und ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, kofinanziert durch das Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), im Rahmen des Partnerschaftsabkommens Portugal 2020, durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) und Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Die in diesem Manuskript beschriebenen Arbeiten wurden durch die Zuschüsse LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) und SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) an M.M., die Forschungsinfrastruktur Congento, das Projekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170 und das PhD-Stipendium PD/BD/128426/2017 an A.D.

Materials

Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20×20 mm #0 (any) 100um thick
Coverglass 20×20 mm #1 (any) 170um thick
Coverglass 20×60 mm #1.5 (any) To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft Commerial software tool
Slide, depression concave glass – 75×25 mm (any) To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

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Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

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