Summary

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

Published: February 28, 2021
doi:

Summary

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Abstract

A somitogênese é uma marca registrada do desenvolvimento embrionário vertebrado. Há anos, pesquisadores vêm estudando esse processo em uma variedade de organismos usando uma ampla gama de técnicas que englobam abordagens ex vivo e in vitro. No entanto, a maioria dos estudos ainda se baseia na análise de dados bidimensionais (2D) de imagem, que limita a avaliação adequada de um processo de desenvolvimento como extensão axial e somitogênese envolvendo interações altamente dinâmicas em um complexo espaço 3D. Aqui descrevemos técnicas que permitem a aquisição de imagens ao vivo do mouse, processamento de conjunto de dados, visualização e análise em 3D e 4D para estudar as células (por exemplo, progenitoras neuromesodérmicas) envolvidas nesses processos de desenvolvimento. Também fornecemos um protocolo passo-a-passo para tomografia de projeção óptica e microscopia de imunofluorescência de montagem total em embriões de camundongos (da preparação da amostra à aquisição de imagens) e mostramos um pipeline que desenvolvemos para processar e visualizar dados de imagem 3D. Estendemos o uso de algumas dessas técnicas e destacamos características específicas de diferentes softwares disponíveis (por exemplo, Fiji/ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que podem ser usados para melhorar nossa compreensão atual da extensão axial e da formação de somite (por exemplo, reconstruções 3D). Ao todo, as técnicas aqui descritas enfatizam a importância da visualização e análise de dados 3D na biologia do desenvolvimento, e podem ajudar outros pesquisadores a abordar melhor os dados de imagem 3D e 4D no contexto de extensão e segmentação axial vertebrados. Por fim, o trabalho também emprega novas ferramentas para facilitar o ensino do desenvolvimento embrionário dos vertebrados.

Introduction

A formação do eixo do corpo vertebrado é um processo altamente complexo e dinâmico que ocorre durante o desenvolvimento embrionário. No final da gastruição [no camundongo, em torno do dia embrionário (E) 8.0], um grupo de células progenitoras epiblastos conhecidas como progenitores neuromesodérmicos (NMPs) tornam-se um driver chave de extensão axial em uma sequência cabeça a cauda, gerando o tubo neural e tecidos mesodérmicos paraxial durante a formação do pescoço, tronco e cauda 1,2,3,4 . Curiosamente, a posição que esses NMPs ocupam no epiblasto caudal parece desempenhar um papel fundamental na decisão de diferenciar-se em mesoderme ou neuroectoderme5. Embora atualmente não tenhamos uma impressão digital molecular precisa para NMPs, essas células são geralmente pensadas para co-expressar T (Brachyury) e Sox2 5,6. Os mecanismos exatos que regulam as decisões de destino do NMP (ou seja, se tomam rotas neurais ou mesodérmicas) estão apenas começando a ser precisamente definidos. A expressão tbx6 na região primitiva é um marcador inicial da decisão de destino NMP, pois este gene está envolvido na indução e especificação do mesoderme 6,7. Curiosamente, as primeiras células de mesoderme parecem expressar altos níveis de Epha18, e sinalização Wnt/β-catenin, bem como Msgn1 também foram mostrados para desempenhar papéis importantes na diferenciação paraxial de mesoderme e formação de somite 9,10. Uma análise espacial-temporal completa dos NMPs a um nível unicelular certamente será fundamental para entender completamente os mecanismos moleculares que controlam a especificação do mesoderme.

A formação de somites (precursores de vértebras) é uma característica fundamental dos vertebrados. Durante o alongamento axial, o mesoderme paraxial torna-se segmentado em uma série de unidades bilaterais repetitivas conhecidas como somites. O número de somites e o tempo necessário para a formação de novos segmentos variam entre as espécies11,12. A somitogênese envolve oscilações periódicas de sinalização (conhecidas como “relógio de segmentação”) que podem ser observadas pela expressão cíclica de vários genes das vias de sinalização Notch, Wnt e Fgf no mesoderme presomático (por exemplo, Lfng)11,12. O modelo atual de somitogênese também postula a existência de uma “frente de onda de maturação”, uma série de gradientes de sinalização complexos envolvendo fgf, Wnt e sinal de ácido retinóico que definem a posição da borda posterior de cada novo somite. Uma interação coordenada entre o “relógio de segmentação” e a “frente de onda de maturação” é, portanto, fundamental para a geração desses módulos precursores de vértebras, pois perturbações nesses principais processos morfogenéticos podem resultar em letalidade embrionária ou na formação de malformações congênitas (por exemplo, escoliose)13,14,15.

Apesar dos avanços recentes substanciais em técnicas de imagem, métodos de análise de bioimagem e software, a maioria dos estudos de alongamento axial e somitogênese ainda dependem de dados de imagem bidimensionais únicos/isolados (por exemplo, seções), o que não permite uma visualização completa do tecido multidimensional e complica a clara diferenciação entre malformações patológicas (ou seja, devido a mutações) versus variação morfológica normal ocorrendo durante o desenvolvimento embrionário16 . A imagem em 3D já descobriu novos movimentos morfogenéticos, anteriormente não identificados pelos métodos 2D padrão 17,18,19,20, destacando o poder do into imaging para entender os mecanismos da somitogênese vertebrado e extensão axial.

A microscopia 3D e 4D de embriões de camundongos, particularmente imagens vivas, são tecnicamente desafiadoras e requerem passos críticos durante a preparação da amostra, aquisição de imagens e pré-processamento de dados, a fim de permitir uma análise espátula-temporal precisa e significativa. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para imagens ao vivo e coloração de imunofluorescência de montagem total de embriões de camundongos, que podem ser usados para estudar tanto NMPs quanto células mesodérmicas durante a extensão e segmentação axiais. Além disso, descrevemos também um protocolo para tomografia de projeção óptica (OPT) de embriões e fetos mais antigos, que permite a visualização 3D em toto e quantificação de anormalidades patológicas que podem resultar de problemas durante a somitogênese (por exemplo, fusão óssea e escoliose)13,21,22. Por fim, ilustramos o poder das reconstruções de imagens 3D no estudo e ensino da segmentação de vertebrados e alongamento axial.

Protocol

Experimentos envolvendo animais seguiram as legislações portuguesa (Portaria 1005/92) e europeia (Diretiva 2010/63/UE) relativas à habitação, à pecuária e ao bem-estar. O projeto foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Gulbenkian de Ciência e pela Entidade Nacional Portuguesa, ‘Direcção Geral de Alimentação e Veterinária’ (referência de licença: 014308). 1. Preparação da amostra para imagens 3D e 4D NOTA: Aqui fornecemos uma descri…

Representative Results

Os resultados representativos apresentados neste artigo tanto para a imagem de imunofluorescência ao vivo quanto para a imunofluorescência, foram obtidos utilizando-se um sistema de dois fótons, com um objetivo de água de 20 × 1.0 NA, o laser de excitação sintonizado em 960 nm, e os fotodetetores GaAsP (conforme descrito em Dias et al. (2020)43. A tomografia de projeção óptica foi feita utilizando um scanner OPenT construído sob medida (como descrito em Gualda et al. (2013)<sup class="x…

Discussion

Alongamento axial e segmentação são dois dos processos mais complexos e dinâmicos que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário vertebrado. O uso de imagens 3D e 4D com rastreamento unicelular tem sido aplicado, há algum tempo, para estudar esses processos tanto em embriões de zebrafish quanto de frango, para os quais as condições de acessibilidade e cultura facilitam imagens complexas 19,44,45,46,47,48,49</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Olivier Pourquié e Alexander Aulehla pela estirpe repórter da LuVeLu, o laboratório SunJin para a amostra de teste RapiClear, Hugo Pereira pela ajuda usando o BigStitcher, Nuno Granjeiro para ajudar a montar o aparelho de imagem ao vivo, a instalação animal do IGC e membros passados e presentes do laboratório Mallo para comentários e apoio úteis durante este trabalho.

Agradecemos o apoio técnico do Advanced Imaging Facility da IGC, que é apoiado pelo ref de financiamento português# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, co-financiado pelo Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), no âmbito do Acordo de Parceria Portugal 2020, por meio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado por subvenções LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) e SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) a M.M., a infraestrutura de pesquisa Congento, o projeto LISBOA-01-0145-FEDER-022170 e a bolsa de doutorado PD/BD/128426/2017 para A.D.

Materials

Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20×20 mm #0 (any) 100um thick
Coverglass 20×20 mm #1 (any) 170um thick
Coverglass 20×60 mm #1.5 (any) To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft Commerial software tool
Slide, depression concave glass – 75×25 mm (any) To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

References

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
  41. . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
  42. . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).

Play Video

Cite This Article
Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

View Video